劉佳怡, 王建青, 迪麗努爾·阿吉, 汪振華, 王 媛， 楊譯輝

(1烏魯木齊市口腔醫(yī)院修復(fù)科, 烏魯木齊 830002; 2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科， 烏魯木齊 830054)

先天性牙齒缺失是人類(lèi)較常見(jiàn)的牙齒發(fā)育異常疾病，屬牙發(fā)育異常中的數(shù)目異常，其發(fā)病率為1.6%～20%[1]。本課題組對(duì)新疆不同民族恒牙先天缺失情況進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查顯示其總患病率為5.98%[2]。發(fā)生先天缺牙的原因是牙胚在形成過(guò)程中未能發(fā)育或未形成牙齒，或是在牙胚發(fā)育的早期，即牙蕾形成期的先天性異常[3]。現(xiàn)已證實(shí)家族遺傳的先天缺牙可以常染色體顯性、常染色體隱性或 X染色體形式遺傳[4-7]。

本研究收集3個(gè)新疆維吾爾族先天缺牙家系，采取候選基因篩查法，檢測(cè)與先天缺牙密切相關(guān)的軸抑制基因-2(AXIN2)片段在相關(guān)家系中的突變位置和類(lèi)型，探討先天缺牙家系患者相關(guān)基因的突變位點(diǎn)，從而為新疆維吾爾族人群先天缺牙的發(fā)病機(jī)制提供基因?qū)W參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床資料納入標(biāo)準(zhǔn)：口內(nèi)有不同程度先天缺牙，牙發(fā)育期無(wú)外傷史、放射史、孕期感染及服藥史、拔牙史, 并且不伴有其他全身疾病。收集3個(gè)來(lái)自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科門(mén)診收治的維吾爾族非綜合征型先天缺牙家系，患者9例(女性7例，男性2例)，其中表型正常者3例，年齡8～46歲。經(jīng)?？茩z查并拍攝全口曲面斷層片確認(rèn)口內(nèi)伴有不同數(shù)目的先天缺失牙, 診斷為非綜合征型先天缺牙，系譜圖如圖1。同時(shí)隨機(jī)抽取150例與先天缺牙家系無(wú)血緣關(guān)系的新疆醫(yī)科大學(xué)在校維吾爾族學(xué)生作為健康對(duì)照組，年齡18～24歲。所有病例和正常對(duì)照組成員均簽署知情同意書(shū)后提取其頰黏膜拭子樣本，并通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

圖1 先天性缺牙家系系譜圖

1.2臨床病例及家系情況收集家系一：先證者，女性(病例Ⅰ)，32歲，籍貫新疆，因全口多數(shù)牙缺失就診；家系二：先證者，女性(病例Ⅴ)，21歲，籍貫新疆,先證者和其父(病例Ⅵ)口內(nèi)情況見(jiàn)表1，2例表型正常者為先證者的姐姐；家系三：先證者，女性(病例Ⅷ)，11歲，籍貫新疆,先證者妹妹(病例Ⅶ)為混合牙列期，以上患者的口內(nèi)缺失牙情況見(jiàn)表1。

該家系缺失最多的為第三磨牙,所有患者均有不同程度牙缺失,其次是第一前磨牙和第二前磨牙、側(cè)切牙,并且病例Ⅰ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅻ伴有錐形牙的發(fā)生。3個(gè)家系成員不伴有其他系統(tǒng)性疾病的發(fā)生, 可初步診斷為非綜合征型先天缺牙。3個(gè)家系先證者全口曲面斷層片見(jiàn)圖2。

表1 先天性恒牙缺失牙位記錄

注： *為先天缺失牙位；▲為錐形牙牙位。

1.3方法

1.3.1 基因組DNA提取 采集患者和健康對(duì)照者頰黏膜拭子, 提取基因組DNA(按北京博邁德科技發(fā)展有限公司提供的試劑盒說(shuō)明操作)，用紫外分光光度計(jì)ND1000檢測(cè)所提取DNA的純度及濃度, 光吸收值(260 nm/280 nm)為1.8～2.0判為DNA純度合格。工作濃度為100 ng/μL,樣本-20℃保存。

a：家系一(病例Ⅰ)

b：家系二(病例Ⅴ)

c：家系三(病例Ⅷ)

圖23個(gè)家系先證者曲面斷層片

1.3.2 PCR引物設(shè)計(jì)合成及PCR擴(kuò)增 用GeneTool 1.0 Lite設(shè)計(jì)AXIN2引物(表2)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL:DNA模版2 μL，上、下游引物各1 μL, Master Mix 25 μL， ddH2O 21 μL。PCR 反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性3 min, 94℃變性30 s；退火(57～59℃)30 s, 72℃延伸40 s, 共36個(gè)循環(huán)；72℃修復(fù)延伸5 min，以上反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行。取10 μL PCR產(chǎn)物, 2%瓊脂糖凝膠150 V、100 mA、30 min電泳觀察電泳檢測(cè)產(chǎn)物特異性。

表2 AXIN2基因擴(kuò)增引物序列

1.3.3 PCR 產(chǎn)物純化及測(cè)序結(jié)果分析 AXIN2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化及DNA雙向序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。根據(jù)測(cè)序結(jié)果和系譜圖, 應(yīng)用DNAman軟件并結(jié)合峰圖進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

AXIN2基因PCR擴(kuò)增片段為單一明亮的條帶,并且出現(xiàn)在需要的特定位點(diǎn)上,表示PCR擴(kuò)增合格(圖3)。 對(duì)3個(gè)先天缺牙家系的9例患者進(jìn)行基因檢測(cè)并與野生型基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，病例Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的AXIN2基因在外顯子2的第264位和第547位、外顯子6第162位與外顯子11的第922位和第1 141位點(diǎn)有突變。病例Ⅰ(家系一先證者)外顯子2第264位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的密碼子由ACA→GCA，蘇氨酸變?yōu)楸彼?，發(fā)生了錯(cuò)義突變(圖4a)。第547位點(diǎn)對(duì)應(yīng)密碼子由CAA→CGA，谷氨酰胺變?yōu)榫彼?，也發(fā)生了錯(cuò)義突變(圖4b)。病例Ⅲ(家系一先證者姐姐)外顯子6第162位CCG→CTG，發(fā)生錯(cuò)義突變，脯氨酸變?yōu)榱涟彼?圖4c)。病例Ⅰ(家系一先證者)外顯子11第922位點(diǎn)對(duì)應(yīng)密碼子由GAT→GAG，發(fā)生錯(cuò)義突變，天冬氨酸變?yōu)楣劝彼?圖4d)。病例Ⅰ(家系一先證者)第1 141位點(diǎn)對(duì)應(yīng)密碼子由ACT→ACA，仍編碼蘇氨酸，發(fā)生同義突變(圖4e)。病例Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和150例健康對(duì)照DNA檢測(cè)中均未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。

圖3 AXIN2基因PCR擴(kuò)增片段分析

3 討論

牙齒的發(fā)育是由多基因調(diào)控的復(fù)雜遺傳過(guò)程[8], 有200多個(gè)基因參與了牙胚的發(fā)育過(guò)程[9-10]，且這些基因在空間上有序的調(diào)控作用決定了牙胚發(fā)育的進(jìn)程[11]。AXIN2、MSX1、PAX9等基因是已經(jīng)研究證實(shí)的與家族性先天缺牙有關(guān)的基因[12]。其在牙齒發(fā)育過(guò)程中表達(dá)于口腔上皮和其下方的間充質(zhì)中，在前期成牙本質(zhì)細(xì)胞、釉結(jié)、成牙本質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)[13]。AXIN2對(duì)牙胚發(fā)育的內(nèi)源性信號(hào)WNT的影響也使其在牙胚的增殖、分化和凋亡中起到重要的作用[14-16]。

a： 病例Ⅰ(家系一先證者)； b： 病例Ⅳ(家系一先證者姐姐)； c：病例Ⅳ(家系一先證者姐姐)； d： 病例Ⅰ(家系一先證者)； e： 病例Ⅰ(家系一先證者)；

圖4AXIN2基因片段測(cè)序結(jié)果

本研究對(duì)所有病例測(cè)序結(jié)果顯示：AXIN2基因外顯子2、外顯子6和外顯子11中的5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)可能與先天缺牙有關(guān)，病例Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ外顯子2的第264位點(diǎn)A→G，密碼子由ACA→GCA，蘇氨酸變?yōu)楸彼?；病例Ⅰ、Ⅳ外顯2第547位A→G，密碼子由CAA→CGA谷氨酰胺變?yōu)榫彼?；病例Ⅰ、Ⅳ外顯子6第162位C→T，密碼子CCG→CTG，脯氨酸變?yōu)榱涟彼?；病例Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ外顯子11第922位T→G，密碼子GAT→GAG，天冬氨酸變?yōu)楣劝彼?；以?個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生錯(cuò)義突變；病例Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ外顯子11第1 141位T→A，密碼子ACT→ACA，發(fā)生同義突變，仍編碼蘇氨酸。國(guó)外曾有外顯子2的第264和第547位、外顯子6的第162位和外顯子11的第1 141位點(diǎn)可能導(dǎo)致先天多數(shù)牙缺失的報(bào)道[16-17]，而外顯子11的第922位點(diǎn)還未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。錯(cuò)義突變改變了編碼的氨基酸,極有可能導(dǎo)致牙齒的異常發(fā)育；而同義突變也有可能影響相關(guān)基因的表達(dá), 盡管同義突變不改變氨基酸的名稱, 但有可能影響其表達(dá)量，也可導(dǎo)致肽鏈的提前終止，極有可能影響蛋白的功能, 進(jìn)而引起牙齒發(fā)育異常, 導(dǎo)致多數(shù)牙先天缺失[18]。

同時(shí),從本研究測(cè)序結(jié)果可看出，病例的突變位點(diǎn)存在交叉，可能說(shuō)明AXIN2導(dǎo)致先天缺牙的SNP多肽性位點(diǎn)間存在關(guān)聯(lián)性，部分先天缺牙患者AXIN2的基因突變位點(diǎn)相同, 但缺牙的位置、數(shù)目等臨床表現(xiàn)卻不盡相同，說(shuō)明了AXIN2不是先天缺牙的唯一致病基因, 其他相關(guān)基因(如PAX9、MSX1等)的基因缺陷都有可能引起牙先天缺失。根據(jù)家系系譜圖分析可知3個(gè)先天缺牙家系均為常染色體顯性遺傳。家系患者Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ除口內(nèi)第三磨牙缺失外也可見(jiàn)其它牙位的缺失, 但其基因檢測(cè)結(jié)果卻未發(fā)現(xiàn)異常位點(diǎn),進(jìn)一步說(shuō)明了牙齒發(fā)育的復(fù)雜性。

在AXIN2檢測(cè)到的多態(tài)性位點(diǎn)以及錯(cuò)義、同義突變, 表明人類(lèi)的遺傳與突變總是伴隨發(fā)生的, 基因的多態(tài)性常在不同層面體現(xiàn)[19]。通過(guò)牙齒畸形表現(xiàn)型及牙位的不同，人們推測(cè)可能存在另一種機(jī)制造成牙齒發(fā)育不全[20]。Parkin等[21]對(duì)同一先天缺牙家系中各成員缺牙數(shù)目和缺牙牙位進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)其相互間有較大差異, 得出先天缺牙的發(fā)生不僅由遺傳因素控制，環(huán)境和后天因素也對(duì)其起到重要作用的結(jié)論，而且基因的突變是否影響蛋白質(zhì)的功能, 其功能可能還受到環(huán)境因素、種族、性別、分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等諸多因素的制約[22]。因此我們認(rèn)為是否有除AXIN2之外的其他基因或是由多基因相互影響造成先天缺牙還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 徐秀敏，李午麗，奧小瑩，等.11名少牙畸形病人Pax9、Msx1、Axin2基因突變的檢測(cè)[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2008,18(12):673-677.

[2] 王霏霏,迪麗努爾·阿吉,張婕，等.新疆5150名大學(xué)生恒牙先天缺失的調(diào)查分析[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(4)：453-455.

[3] 葉年嵩，王晟，賴文莉.非綜合征性先天缺牙相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J].國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志,2011,38(4)：416-422.

[4] Zhao J, Hu Q, Chen Y, et al. A novel missense mutation in the paired domain of human PAX9 causes oligodontia[J]. Med Genet Part A,2007, 143A: 2592-2597.

[5] Frazier- Bowers SA, Guo DC, Cavender A, et al.A novel mutation in human Pax9 causes molar oligodontia[J] . J Dent Res, 2002, 81 (2): 129-133.

[6] 王曉方,劉嘉利,張海濱,等.一個(gè)腘翼綜合征(PPS)家系IRF6基因的突變檢測(cè)[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2003,13(6):304-307.

[7] 金永哲，王民艷，楊秀玲,等. 單純性恒牙先天缺失特點(diǎn)的臨床分析[J].中國(guó)婦幼保健，2011,34(26)：5405-5406.

[8] Tallon-Walton V, Manzanares-Cespedes MC, Arte S, et al. Identification of a novel mutation in the PAX9 gene in a family affected by oligodontia and other dental anomalies[J]. Eur J Oral Sci,2007, 115(6):427-432.

[9] Thesleff I, Kernen S, Jernvall J. Enamel knots as signaling centers linking tooth morphogenesis and odontoblast differentiation [J].Adv Dent Res, 2001,15(1):14-18.

[10] Bei M. Molecular genetics of tooth development [J].Curr Opin Genet Dev, 2009, 19(5):504-510.

[11] 林敏魁,王海亮,閆福華. Axin2、Wnt5a以及Shh基因在小鼠磨牙胚帽狀期中的表達(dá)[J]. 福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,44(5)：328-330.

[12] Nieminen P. Genetic basis of tooth agenesis [J].J Exp Zool B Mol Dev Evol, 2009,312(B):320-342.

[13] Lammi L, Arte S, Somer M, et al. Mutations in AXIN2 cause familial tooth agenesis and predispose to colorectal cancer [J]. Am J Hum Genet, 2004,74(5):1043-1050.

[14] Kong H, Wang Y, Patel M, et al. Regulation of bmp4 expression in odontogenic mesenchyme: from simple to complex[J]. Cells Tissues Organs, 2011,194(2-4):156-160.

[15] Li L, Yuan G, Liu C, et al. Exogenous fibroblast growth factor 8 rescues development of mouse di-astemal vestigial tooth ex vivo[J]. Dev Dyn, 2011,240(6):1344-1353.

[16] Fujimori S, Novak H, Weissenb?ck M, et al. Wnt/β-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4[J]. Dev Biol, 2010,348(1):97-106.

[17] Callahan N, Modesto A, Meira R, et al. Axis inhibition protein2(AXIN2) polymorphisms and tooth agenesis[J] . Arch Oral Biol,2009, 54(1):45-49.

[18] Mostowska A, Biedziak B, Pawel P. Axis inhibition protein2 (AXIN2)polymorphisms may be a risk factor for selective tooth agenesis[J]. Hum Genet,2006,51:262-266.

[19] 袁林天 文玲英 陳金武,等. 多數(shù)牙先天缺失可能與MSX1上的3個(gè)SNPs相關(guān)[J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志.2009,25(1):47-50.

[20] 楊 艷，張義磊. 1例非綜合征型先天缺牙家系的基因篩查[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011,3(32):343-348.

[21] 崔娟娟，李午麗，梅陵宣. PAX 9基因與非綜合征型多數(shù)牙先天缺失的關(guān)系及研究進(jìn)展[J].國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志,2008,1(35)：38-40.

[22] Parkin N, Elcock C, Smith RN, et al. The aetiology of hypodonia: the prevalence, severity and location of hypodontia with in families[J]. Arch Oral Biol,2009,54(1):52-56.