張勇　周麗明

摘要：以廢啤酒酵母為原料，采用NaOH溶液提取堿不溶性酵母胞壁多糖，用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明：最佳提取工藝條件為：料液比為1 g ∶10 mL，處理時(shí)間1 h，處理溫度100 ℃，堿液濃度1 mol/L，在此工藝條件下酵母胞壁多糖提取率為2.88%。

關(guān)鍵詞：堿不溶性；胞壁多糖；廢啤酒酵母；提取工藝

中圖分類號： TS261.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0230-02

收稿日期：2013-04-22

作者簡介：張勇（1978—），男，湖北襄陽人，碩士，講師，從事生物活性物質(zhì)研究。E-mail：1328662368@qq.com。酵母細(xì)胞壁中存在堿不溶性葡聚糖、堿溶性葡聚糖、酸溶性葡聚糖等物質(zhì)。其中不溶性葡聚糖具有黏性高、熱穩(wěn)定性好以及制備工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、造紙、建筑等行業(yè)[1]。我國酵母資源豐富，年產(chǎn)啤酒沉淀酵母泥3萬～5萬t（干基）[2]。啤酒酵母細(xì)胞壁含有大量多糖，約占酵母細(xì)胞干重的40%[3]。目前關(guān)于從啤酒廢酵母中提取蛋白質(zhì)、核酸、谷胱甘肽等研究很多[4]，對其胞壁多糖的研究尚不多見。筆者對從廢啤酒酵母中提取堿不溶性酵母胞壁多糖的工藝條件進(jìn)行了研究，旨在為廢啤酒酵母的綜合利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

廢啤酒酵母（湖北金龍泉啤酒有限公司）、試劑均為國產(chǎn)分析純，320-S型pH計(jì)[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）]，DZT-6020型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），722S型可見光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），HN-12A型紅外消化爐（上海勇規(guī)分析儀器有限公司）。

1.2溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液制備：取105 ℃干燥至恒重的D-葡萄糖，精確稱重，配成濃度為3.62 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用前用蒸餾水稀釋成濃度為0.036 2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用液。80%苯酚：80 g苯酚（分析純重蒸餾試劑），加20 g水使之溶解，置冰箱中長期避光貯存。6%苯酚：臨用前用80%苯酚配制。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作采用苯酚-硫酸法[5]。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL于試管中，各加水補(bǔ)至2.0 mL，另一試管加入2.0 mL蒸餾水作為空白對照。各試管分別加入6%苯酚1.0 mL，然后冷水浴中迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，并于冷水浴中放置5 min，再置于沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫后于490 nm處測其吸光度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2酵母胞壁多糖提取與純化方法堿不溶性葡聚糖提取與純化工藝流程如下：廢啤酒酵母→堿液處理→中和→溶劑洗滌→干燥→酵母胞壁多糖。用一定濃度一定體積的堿液（NaOH）對100 g廢啤酒酵母在一定溫度下攪拌一定時(shí)間，冷卻后用HCl調(diào)節(jié)pH值為 4.5，3 000 r/min離心20 min后棄上清液，沉淀即為酵母胞壁多糖粗品。用200 mL蒸餾水洗出沉淀，100 ℃水浴20 min，3 000 r/min離心20 min；用100 mL 95%乙醇洗出沉淀，用電動(dòng)攪拌器攪拌15 min后3 000 r/min離心20 min，重復(fù)1次；用100 mL丙酮洗出沉淀，攪拌15 min后3 000 r/min離心20 min，重復(fù)1次；用100 mL無水乙醚洗出沉淀，攪拌15 min，3 000 r/min離心20 min，沉淀置于沸水浴中揮發(fā)殘余無水乙醚；最后置于37 ℃下真空烘干，即得酵母胞壁多糖成品。

1.3.3酵母胞壁多糖中多糖含量測定方法[6]稱取約 10 mg 酵母胞壁多糖，用20 mL 3 mol/L H2SO4于100 ℃水浴 90 min，然后將水解液定容至250 mL。吸取水解液1.0 mL，按“1.3.1”節(jié)方法操作，測其吸光度值。根據(jù)回歸方程計(jì)算水解液中多糖的濃度，按下式計(jì)算酵母胞壁多糖提取率。

多糖提取率=水解液中多糖濃度（mg/L）×250×胞壁多糖成品質(zhì)量（g）1稱取的胞壁多糖質(zhì)量（mg）×廢啤酒酵母質(zhì)量（g）×100%

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，葡萄糖含量在0～0.065 16 mg范圍內(nèi)與其吸光度值線性關(guān)系良好，在此范圍內(nèi)的線性回歸方程為：y=0.005 7x+0.000 8，r=0.999 8。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1料液比對酵母胞壁多糖提取率的影響在處理溫度為100 ℃、處理時(shí)間為1 h條件下，選擇料液比（g ∶mL）分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25，將廢啤酒酵母懸浮于 1 mol/L NaOH溶液中，考察料液比對酵母胞壁多糖提取率的影響。由圖2可知，當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶10 mL時(shí)酵母胞壁多糖提取率達(dá)到最大，繼續(xù)減小料液比，多糖提取率下降，這可能是由于NaOH用量增大后，在溶出雜質(zhì)的同時(shí)對多糖也有一定的破壞性，所以確定料液比為1 g ∶10 mL。

2.2.2處理時(shí)間對酵母胞壁多糖提取率的影響在處理溫度為100 ℃、料液比為1 g ∶10 mL條件下，將廢啤酒酵母懸浮于 1 mol/L NaOH溶液中分別處理0.5、1、1.5、2、2.5 h，考察處理時(shí)間對酵母胞壁多糖提取率的影響。由圖3可知，當(dāng)處理時(shí)間為1 h時(shí)，提取率達(dá)到最大，之后再延長處理時(shí)間，提取率反而下降?？梢姡籼幚頃r(shí)間過長，在除去雜質(zhì)的同時(shí)也會破壞多糖，致使提取率下降，所以1 h為最佳處理時(shí)間。

2.2.3處理溫度對酵母胞壁多糖提取率的影響在料液比為1 g ∶10 mL的條件下，選擇處理溫度分別為60、70、80、90、100 ℃，將廢啤酒酵母懸浮于1 mol/L的NaOH溶液中處理 1 h，考察處理溫度對酵母胞壁多糖提取率的影響。由圖4可知，當(dāng)處理溫度為100 ℃時(shí)，提取率最高。這可能是由于溫度比較低時(shí)，堿溶不徹底，雜質(zhì)較多，故選擇處理溫度為100 ℃。endprint

2.2.4堿液濃度對酵母胞壁多糖提取率的影響在處理溫度為100 ℃、料液比為1 g ∶10 mL的條件下，將廢啤酒酵母分別懸浮于0.5、0.75、1、1.25、1.5 mol/L NaOH溶液中處理1 h，考察堿液濃度對酵母胞壁多糖提取率的影響。由圖5可知，當(dāng)堿液濃度為1 mol/L時(shí)提取率最高。隨著堿液濃度的提高，雜質(zhì)不斷被溶解的同時(shí)多糖也在一定程度上被降解，堿液濃度越大，對多糖的破壞越嚴(yán)重，故選擇堿液濃度為1 mol/L。

2.3酵母胞壁多糖提取最佳工藝的確定

為了確定酵母胞壁多糖提取最佳工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了4因素3水平正交試驗(yàn)L9（34）（表1）。由表2可知，4種因素對酵母胞壁多糖提取率影響的主次順序依次為：料液比>堿液濃度>處理時(shí)間>處理溫度。酵母胞壁多糖的最佳提取條件是A1B1C3D2，即料液比為1 g ∶10 mL，處理時(shí)間1 h，處理溫度100 ℃，堿液濃度1 mol/L。按此條件進(jìn)行試驗(yàn)，酵母胞壁多糖提取率為2.88%。

3結(jié)論

本研究表明，NaOH溶液提取堿不溶性酵母胞壁多糖的

最佳工藝條件為料液比1 ∶10，處理時(shí)間1 h，處理溫度 100 ℃，堿液濃度1 mol/L，在此工藝條件下酵母胞壁多糖提取率為2.88%。

參考文獻(xiàn)：

[1]胡曉忠，馮萬祥. 酵母葡聚糖的制備及理化性質(zhì)[J]. 華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，25（5）：477-479.

[2]黃國宏，李科德，曾慶孝. 酵母β-1，3-葡聚糖研究進(jìn)展[J]. 釀酒科技，2006（12）：100-103.

[3]段勝林，王雪，苑鵬，等. 采用催化自溶和生物破壁技術(shù)提取啤酒酵母細(xì)胞壁多糖[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（5）：138-143.

[4]楊建梅. 啤酒廢酵母中β-1，3-D-葡聚糖的制備及性質(zhì)研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[5]張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M]. 杭州：浙江大學(xué)出版社，1999：132-136.

[6]張勇. 酵母多糖的研究——產(chǎn)多糖酵母菌株篩選、發(fā)酵工藝及酵母多糖提取、分離純化和免疫活性的研究[D]. 武漢：湖北工業(yè)大學(xué)，2005.吳真，林鹿. 麥草水解殘?jiān)苽浠钚蕴縖J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：232-233.endprint

2.2.4堿液濃度對酵母胞壁多糖提取率的影響在處理溫度為100 ℃、料液比為1 g ∶10 mL的條件下，將廢啤酒酵母分別懸浮于0.5、0.75、1、1.25、1.5 mol/L NaOH溶液中處理1 h，考察堿液濃度對酵母胞壁多糖提取率的影響。由圖5可知，當(dāng)堿液濃度為1 mol/L時(shí)提取率最高。隨著堿液濃度的提高，雜質(zhì)不斷被溶解的同時(shí)多糖也在一定程度上被降解，堿液濃度越大，對多糖的破壞越嚴(yán)重，故選擇堿液濃度為1 mol/L。

2.3酵母胞壁多糖提取最佳工藝的確定

為了確定酵母胞壁多糖提取最佳工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了4因素3水平正交試驗(yàn)L9（34）（表1）。由表2可知，4種因素對酵母胞壁多糖提取率影響的主次順序依次為：料液比>堿液濃度>處理時(shí)間>處理溫度。酵母胞壁多糖的最佳提取條件是A1B1C3D2，即料液比為1 g ∶10 mL，處理時(shí)間1 h，處理溫度100 ℃，堿液濃度1 mol/L。按此條件進(jìn)行試驗(yàn)，酵母胞壁多糖提取率為2.88%。

3結(jié)論

本研究表明，NaOH溶液提取堿不溶性酵母胞壁多糖的

最佳工藝條件為料液比1 ∶10，處理時(shí)間1 h，處理溫度 100 ℃，堿液濃度1 mol/L，在此工藝條件下酵母胞壁多糖提取率為2.88%。

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2.2.4堿液濃度對酵母胞壁多糖提取率的影響在處理溫度為100 ℃、料液比為1 g ∶10 mL的條件下，將廢啤酒酵母分別懸浮于0.5、0.75、1、1.25、1.5 mol/L NaOH溶液中處理1 h，考察堿液濃度對酵母胞壁多糖提取率的影響。由圖5可知，當(dāng)堿液濃度為1 mol/L時(shí)提取率最高。隨著堿液濃度的提高，雜質(zhì)不斷被溶解的同時(shí)多糖也在一定程度上被降解，堿液濃度越大，對多糖的破壞越嚴(yán)重，故選擇堿液濃度為1 mol/L。

2.3酵母胞壁多糖提取最佳工藝的確定

為了確定酵母胞壁多糖提取最佳工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了4因素3水平正交試驗(yàn)L9（34）（表1）。由表2可知，4種因素對酵母胞壁多糖提取率影響的主次順序依次為：料液比>堿液濃度>處理時(shí)間>處理溫度。酵母胞壁多糖的最佳提取條件是A1B1C3D2，即料液比為1 g ∶10 mL，處理時(shí)間1 h，處理溫度100 ℃，堿液濃度1 mol/L。按此條件進(jìn)行試驗(yàn)，酵母胞壁多糖提取率為2.88%。

3結(jié)論

本研究表明，NaOH溶液提取堿不溶性酵母胞壁多糖的

最佳工藝條件為料液比1 ∶10，處理時(shí)間1 h，處理溫度 100 ℃，堿液濃度1 mol/L，在此工藝條件下酵母胞壁多糖提取率為2.88%。

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[6]張勇. 酵母多糖的研究——產(chǎn)多糖酵母菌株篩選、發(fā)酵工藝及酵母多糖提取、分離純化和免疫活性的研究[D]. 武漢：湖北工業(yè)大學(xué)，2005.吳真，林鹿. 麥草水解殘?jiān)苽浠钚蕴縖J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：232-233.endprint