埃及品系尼羅羅非魚不同選育世代間遺傳潛力分析

王騰+肖煒+李大宇+鄒芝英+祝璟琳+樂貽榮+楊弘

摘要：選用25個微衛(wèi)星基因座對連續(xù)3個選育世代的埃及品系尼羅羅非魚進行檢測，通過分析世代間的遺傳差異來探討埃及品系尼羅羅非魚的保種現(xiàn)狀和遺傳潛力。結(jié)果表明，3個世代群體在25個微衛(wèi)星基因座中共檢測出105個等位基因，不同基因座上的等位基因數(shù)為2～7，3個世代群體的平均有效等位基因數(shù)（Ae）分別為2.59、2.52、230個，平均期望雜合度（He）分別為0.547、0.545、0.518，平均觀測雜合度（Ho）分別為0.479、0.457、0.451，平均多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.487、0.480、0.458，3個世代群體遺傳多樣性水平較高，世代間各遺傳參數(shù)隨世代數(shù)增長呈略微下降趨勢，但差異不顯著（P>0.05）；3個世代間遺傳分化指數(shù)（Fst）在0.017～0.048之間，均小于0.05，遺傳分化程度相對較低；通過分子方差對遺傳變異來源分析表明，經(jīng)過選育群體世代間的遺傳分化較小，世代間變異僅占總變異的334%，分化主要來源于世代內(nèi)個體間的遺傳差異。目前，采用保種選育方法對埃及品系尼羅羅非魚世代間的遺傳信息較為穩(wěn)定，具有較高的遺傳潛力。

關(guān)鍵詞：埃及品系；尼羅羅非魚；選育世代；微衛(wèi)星；遺傳多樣性；遺傳潛力

中圖分類號： S917.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0184-04

收稿日期：2013-07-29

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（編號：CARS-49）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（編號：2013JBFM01）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)人才支撐計劃（編號：2130106）。

作者簡介：王騰（1990—），女，山東臨沂人，碩士，研究方向為魚類遺傳育種。E-mail：wangteng0416@163.com。

通信作者：楊弘（1966—），男，江蘇無錫人，研究員，主要從事魚類育種工作。E-mail：yangh@ffrc.cn。尼羅羅非魚（Orechromis niloticus）原產(chǎn)于非洲，具有生長速度快、食性雜及抗病力強等優(yōu)點，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）向世界各國推薦的主要養(yǎng)殖品種之一。自1978年引進我國以來，羅非魚養(yǎng)殖在我國得到迅速發(fā)展，現(xiàn)已成為我國淡水養(yǎng)殖的重要品種。優(yōu)良的苗種是保證羅非魚成魚品質(zhì)的關(guān)鍵，因此，良種的選擇和培育是保障優(yōu)良苗種供給、實現(xiàn)我國羅非魚產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的決定性因素。為此，1999年，中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心從埃及農(nóng)業(yè)和農(nóng)墾部水產(chǎn)研究中心實驗室引進尼羅羅非魚基礎群體5 000尾，在南泉養(yǎng)殖基地采用閉鎖群體繼代選育法，以生長速度和尾鰭條紋為主要選擇目標，2年1個世代，選擇總強度為30%左右。經(jīng)過多年選育，該群體生長、經(jīng)濟性狀進一步得到提高，現(xiàn)已成為1個新的優(yōu)良品系[1]。目前，群體選育法已經(jīng)較多地用于羅非魚的選育工作，往往重視經(jīng)濟性狀的選擇，在分子水平上對遺傳變化的跟蹤研究卻較少，忽略了群體遺傳型變化可能會導致遺傳多樣性的降低，從而降低遺傳效應，造成遺傳瓶頸效應。

近年來，分子標記技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于水產(chǎn)動物的親緣關(guān)系鑒定、物種多樣性檢測、種質(zhì)資源的保護以及基因連鎖圖譜的構(gòu)建和基因定位等領域[2-5]，在開展品種選育時，對群體遺傳結(jié)構(gòu)影響的研究也有一些成果。Romana-Eguia等利用微衛(wèi)星標記對尼羅羅非魚不同選育世代的研究、Patricia等利用RAPD技術(shù)對不同世代凡納濱對蝦群體遺傳多樣性的分析，結(jié)果均顯示選育世代遺傳多樣性有逐代降低的趨勢[6-7]；頡曉勇等對吉富品系尼羅羅非魚選育群體遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)，隨著選育的進行，群體遺傳參數(shù)逐漸降低，群體呈現(xiàn)出純化趨勢[8]。本研究擬采用微衛(wèi)星標記對埃及品系尼羅羅非魚3個世代保種群遺傳變異進行檢測，初步評價埃及品系尼羅羅非魚在現(xiàn)有選育方式下的保種現(xiàn)狀及遺傳潛力，了解尼羅羅非魚在保種選育過程中遺傳型的變化，為制定更加合理有效的保種方案提供理論依據(jù)，為其他品種的引種和保種工作提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.2方法

1.2.1基因組DNA的制備采用常規(guī)酚-氯仿法制備基因組DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其濃度和純度，稀釋至100 ng/μL，作為PCR擴增的模板。

1.2.2微衛(wèi)星引物的設計本研究中使用的引物均從已發(fā)表的尼羅羅非魚遺傳連鎖圖譜中選取[9]，按照互不連鎖的原則，從不同的連鎖群中選擇具有多態(tài)性的25個微衛(wèi)星基因座，相關(guān)信息見表1。引物由上海申能博彩公司合成。

1.2.3PCR擴增及電泳檢測反應體系：10×Buffer（Mg2+ Free）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL，微衛(wèi)星上下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，Taq-DNA聚合酶1 U，DNA模板（100 ng/μL）1 μL，補無菌去離子水至25 μL。反應程序：94 ℃變性5min；94 ℃變性30 s，各引物 55～62 ℃ 復性30 s，72 ℃延伸35 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用PopGene 1.32軟件計算每個群體的等位基因數(shù)（observed number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，Ae）、觀測雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）、群體間遺傳距離（genetic distance，Ds）和遺傳相似性系數(shù)（genetic similarity index，I）。利用ARLEQUIN 3.1軟件，計算群體遺傳分化指數(shù)Fst，估計群體間的遺傳分化，分析群體內(nèi)和群體間的分子方差（AMOVA）。根據(jù)Botstein等計算多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）[10]，PIC計算公式為：PIC=1-（∑ni=1P2i）-（∑n-1i=1∑nj=i+12P2iP2j）。式中，n為某一位點上等位基因數(shù)，Pi、Pj分別為第i和第j個等位基因在群體中的頻率，j=i+1。endprint

2結(jié)果與分析

2.1PCR擴增結(jié)果

采用25對微衛(wèi)星引物對3個世代共84尾樣本進行分析比較。由表2可見，25個基因座在3個群體中共檢測到了105個等位基因，大多集中在100～300 bp之間，不同基因座位上的等位基因數(shù)在2～7個之間，平均每個基因座上的等位基因數(shù)為4.2個。采用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到清晰且重復性較好的產(chǎn)物。圖1所示為引物GM277分別在3個群體中的擴增圖譜。

2.23個世代間的遺傳多樣性

由表3可見，3個世代的平均有效等位基因數(shù)（Ae）分別為2.59、2.52、2.30，平均期望雜合度（He）分別為0.547、0545、0.518，平均觀測雜合度（Ho）分別為0.479、0457、0451，平均多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.487、0.480、0.458，3個羅非魚保種選育群體的遺傳多樣性均屬于中度偏高水平。其中，F(xiàn)1代遺傳多樣性最高，F(xiàn)3代最低，呈現(xiàn)出略微下降的趨勢。經(jīng)t檢驗P>0.05，3世代間無明顯差異。

2.33個世代間的遺傳差異

3個羅非魚群體間的Neis遺傳距離（Ds）和遺傳相似系數(shù)見表4。在F1、F2、F3 3個世代中，F(xiàn)1和F3的遺傳距離最大，為0.077，遺傳相似系數(shù)最小，為0.926，說明兩者親緣關(guān)系較遠；F2與F3的遺傳距離最小，為0.040，遺傳相似系數(shù)最大，為0.961，說明兩者親緣關(guān)系較近。

Wright認為，遺傳分化指數(shù)Fst≤0.05表示群體間遺傳分化微弱；0.05

3小結(jié)與討論

3.1埃及尼羅羅非魚各世代保種群的遺傳分析

通過對埃及品系尼羅羅非魚3個世代保種選育群體進行遺傳多樣性檢測，對遺傳多樣性參數(shù)進行比較，結(jié)果顯示，3個羅非魚選育群體平均多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.487、0480、0.458，均處于中度偏高的遺傳多樣性水平[10]，與Hassanien等研究埃及尼羅羅非魚5個野生群體遺傳多樣性得出的結(jié)果（Ae=8.4、Ho=0.702、He=0.869）[12]相比，這3個羅非魚選育群體的遺傳多樣性水平較低（Ae=2.47、Ho=0.462、He=0.537），這可能與引種后尼羅羅非魚為人工養(yǎng)殖群體，并且經(jīng)歷了選育有關(guān)。Macaranas等對尼羅羅非魚非洲野生群體和亞洲養(yǎng)殖群體進行了遺傳差異分析發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖群體遺傳多樣性高于野生群體，推測是由于尼羅羅非魚養(yǎng)殖群體與莫桑比克羅非魚發(fā)生了漸滲雜交的原因[13]。本試驗尼羅羅非魚遺傳多樣性雖然低于其他學者的研究結(jié)果，但其遺傳多樣性仍處于較高水平，3個保種世代群體的遺傳多樣性有逐代降低的趨勢，世代間無明顯差異（P>0.05），這反映了埃及品系尼羅羅非魚保種群體的遺傳多樣性得到了很好的保存，保種選育效果較好。

埃及品系尼羅羅非魚從F1至F3代遺傳差異很?。‵st<0.05），通過分子方差對遺傳變異來源分析，經(jīng)過人工選育，群體世代間遺傳分化并不大，世代間變異僅占總變異的334%，分化主要來源于世代內(nèi)個體間的遺傳差異。F3與F2之間的分化小于F2與F1之間的分化，推測相鄰世代間的分化隨著世代增加可能呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，群體遺傳結(jié)構(gòu)逐漸趨于穩(wěn)定。從 3個選育世代間的遺傳距離和遺傳相似性結(jié)果可以看出，隨著選育的進行，F(xiàn)2、F3與 F1之間的遺傳距離逐漸增大，而遺傳相似性系數(shù)逐漸減小，這表明埃及品系尼羅羅非魚經(jīng)過3代群體選育，人工選擇壓力在一定程度上改變了選育群體的遺傳結(jié)構(gòu)，部分基因座上等位基因頻率發(fā)生改變，可以獲得具有更穩(wěn)定遺傳水平的選育良種。

3.2保種選育方法的可行性探討

保種就是有效地控制群體的近交和遺傳漂變，盡可能多地保存群體原有的基因和雜合度，群體規(guī)模是決定保種效果的基本因素[14]。為了避免種群中某些基因的丟失，生產(chǎn)單位多以大量的群體進行保種和引種。2003年，廣西水產(chǎn)研究所從南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院引進埃及品系尼羅羅非魚種苗51 360尾，經(jīng)多代選育已獲得較為理想的苗種繁育親本[15]，其遺傳多樣性也得到了良好的保存[16]。從維持種群遺傳多樣性的角度來講，保留群體的規(guī)模越大越好，而在實際生產(chǎn)中，如果保留群體規(guī)模過大，就不可避免造成人力、物力資源的大量浪費。本研究以雌魚600尾、雄魚300尾進行保種，群體規(guī)模較小，親魚群體有效大小可達500尾以上，近交增量在0.1%以內(nèi)，理論上可基本避免近親交配[17-18]。從微衛(wèi)星檢測結(jié)果來看，埃及尼羅羅非魚保種群體遺傳多樣性得到了很好的保存，本研究的保種選育方法具有一定的可行性，由于受選育保種數(shù)目所限，選育世代遺傳多樣性發(fā)生了一定程度的變化和下降。另外，本研究僅通過微衛(wèi)星標記對3個世代進行了遺傳方面的分析和探討，還應結(jié)合生長指標、血液生化指標等其他生物學指標對保種效果進行進一步分析，從而制定出更為合理有效的保種方案。

參考文獻：

[1]夏德全 .論羅非魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展[J]. 海洋與漁業(yè)，2003（8）：7-9.

[2]Naish K A，Skibinski D O F. Tetranucleiotide microsatellites loci for Indian major carp[J]. Journal of Fish Biol，1998，53（4）：886-889.

[3]王婷婷，宋學宏，許愛國，等. 應用微衛(wèi)星標記分析4個黃顙魚群體的遺傳多樣性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2012，40（4）：41-45.

[4]Banks M A，Blouin M S，Baldwin B A，et al. Isolation and inheritance of novel microsatellites in chinook salmon（Oncorhynchus tschawytscha）[J]. The Journal of Heredity，1999，90（2）：281-288.

[5]Kocher T D，Lee W J，Sobolewska H，et al. A genetic linkage map of a cichlid fish，the tilapia（Oreochromis niloticus）[J]. Genetics，1998，148（3）：1225-1232.

[6]Romana-Eguia M R，Ikeda M，Basiao Z U，et al. Genetic changes during mass selection for growth in Nile tilapia，Oreochromis niloticus（L.），assessed by microsatellites[J]. Aquaculture Research，2005，36（1）：69-78.

[7]Patricia D F，Pedrom M J. Assessment of the genetic diversity in five generations of a commercial broodstock line of Litopenaeus vannamei shrimp[J]. African Journal of Biotechnology，2005，4（12）：1362-1367.

[8]頡曉勇，李思發(fā)，蔡完其. 吉富品系尼羅羅非魚選育過程中遺傳變異的微衛(wèi)星分析[J]. 水產(chǎn)學報，2007，31（3）：385-390.

[9]Lee B Y，Lee W J，Streelman J T，et al. A second-generation genetic linkage map of tilapia（Oreochromis spp.）[J]. Genetics，2005，170（1）：237-244.

[10]Botstein D，White R L，Skolnick M，et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Genetics，1980，32（3）：314-331.

[11]Wright S. Evolution and the genetics of populations[M]. Chicago：University of Chicago Press，1978：1-30.

[12]Hassanien H A，Gilbey J. Genetic diversity and differentiation of Nile tilapia（Oreochromis niloticus）revealed by DNA microsatellites[J]. Aquaculture Research，2005，36（14）：1450-1457.

[13]Macaranas J M，Agustin L Q，Ablan M A，et al. Genetic improvement of farmed tilapias：biochemical characterization of strain differences in Nile tilapia[J]. Aquaculture International，1995，3（1）：43-54.

[14]Wright S. Evolution in mendelian populations[J]. Genetics，1931，16（2）：97-157.

[15]曹謹玲，陳劍杰，楊弘，等. 埃及品系尼羅羅非魚的選育及其效果分析[J]. 水生生物學報，2010，34（4）：866-871.

[16]肖煒，楊弘，李大宇，等. 同種羅非魚（Tilapia）不同地區(qū)選育群體的遺傳多樣性分析[J]. 海洋與湖沼，2010，41（4）：530-537.

[17]李思發(fā). 魚類繁育群體遺傳性能的保護[J]. 水產(chǎn)學報，1988，12（3）：283-290.

[18]Franklin I R. Evolutionary change in small populations[C]//Soule M E，Wilcox B A. Conservation biology：An evolutionary-ecological perspective. Sunderland：Sinauer Associate，1980：135-150.endprint

[5]Kocher T D，Lee W J，Sobolewska H，et al. A genetic linkage map of a cichlid fish，the tilapia（Oreochromis niloticus）[J]. Genetics，1998，148（3）：1225-1232.

[6]Romana-Eguia M R，Ikeda M，Basiao Z U，et al. Genetic changes during mass selection for growth in Nile tilapia，Oreochromis niloticus（L.），assessed by microsatellites[J]. Aquaculture Research，2005，36（1）：69-78.

[7]Patricia D F，Pedrom M J. Assessment of the genetic diversity in five generations of a commercial broodstock line of Litopenaeus vannamei shrimp[J]. African Journal of Biotechnology，2005，4（12）：1362-1367.

[8]頡曉勇，李思發(fā)，蔡完其. 吉富品系尼羅羅非魚選育過程中遺傳變異的微衛(wèi)星分析[J]. 水產(chǎn)學報，2007，31（3）：385-390.

[9]Lee B Y，Lee W J，Streelman J T，et al. A second-generation genetic linkage map of tilapia（Oreochromis spp.）[J]. Genetics，2005，170（1）：237-244.

[10]Botstein D，White R L，Skolnick M，et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Genetics，1980，32（3）：314-331.

[11]Wright S. Evolution and the genetics of populations[M]. Chicago：University of Chicago Press，1978：1-30.

[12]Hassanien H A，Gilbey J. Genetic diversity and differentiation of Nile tilapia（Oreochromis niloticus）revealed by DNA microsatellites[J]. Aquaculture Research，2005，36（14）：1450-1457.

[13]Macaranas J M，Agustin L Q，Ablan M A，et al. Genetic improvement of farmed tilapias：biochemical characterization of strain differences in Nile tilapia[J]. Aquaculture International，1995，3（1）：43-54.

[14]Wright S. Evolution in mendelian populations[J]. Genetics，1931，16（2）：97-157.

[15]曹謹玲，陳劍杰，楊弘，等. 埃及品系尼羅羅非魚的選育及其效果分析[J]. 水生生物學報，2010，34（4）：866-871.

[16]肖煒，楊弘，李大宇，等. 同種羅非魚（Tilapia）不同地區(qū)選育群體的遺傳多樣性分析[J]. 海洋與湖沼，2010，41（4）：530-537.

[17]李思發(fā). 魚類繁育群體遺傳性能的保護[J]. 水產(chǎn)學報，1988，12（3）：283-290.

[18]Franklin I R. Evolutionary change in small populations[C]//Soule M E，Wilcox B A. Conservation biology：An evolutionary-ecological perspective. Sunderland：Sinauer Associate，1980：135-150.endprint

[5]Kocher T D，Lee W J，Sobolewska H，et al. A genetic linkage map of a cichlid fish，the tilapia（Oreochromis niloticus）[J]. Genetics，1998，148（3）：1225-1232.

[6]Romana-Eguia M R，Ikeda M，Basiao Z U，et al. Genetic changes during mass selection for growth in Nile tilapia，Oreochromis niloticus（L.），assessed by microsatellites[J]. Aquaculture Research，2005，36（1）：69-78.

[7]Patricia D F，Pedrom M J. Assessment of the genetic diversity in five generations of a commercial broodstock line of Litopenaeus vannamei shrimp[J]. African Journal of Biotechnology，2005，4（12）：1362-1367.

[8]頡曉勇，李思發(fā)，蔡完其. 吉富品系尼羅羅非魚選育過程中遺傳變異的微衛(wèi)星分析[J]. 水產(chǎn)學報，2007，31（3）：385-390.

[9]Lee B Y，Lee W J，Streelman J T，et al. A second-generation genetic linkage map of tilapia（Oreochromis spp.）[J]. Genetics，2005，170（1）：237-244.

[10]Botstein D，White R L，Skolnick M，et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Genetics，1980，32（3）：314-331.

[11]Wright S. Evolution and the genetics of populations[M]. Chicago：University of Chicago Press，1978：1-30.

[12]Hassanien H A，Gilbey J. Genetic diversity and differentiation of Nile tilapia（Oreochromis niloticus）revealed by DNA microsatellites[J]. Aquaculture Research，2005，36（14）：1450-1457.

[13]Macaranas J M，Agustin L Q，Ablan M A，et al. Genetic improvement of farmed tilapias：biochemical characterization of strain differences in Nile tilapia[J]. Aquaculture International，1995，3（1）：43-54.

[14]Wright S. Evolution in mendelian populations[J]. Genetics，1931，16（2）：97-157.

[15]曹謹玲，陳劍杰，楊弘，等. 埃及品系尼羅羅非魚的選育及其效果分析[J]. 水生生物學報，2010，34（4）：866-871.

[16]肖煒，楊弘，李大宇，等. 同種羅非魚（Tilapia）不同地區(qū)選育群體的遺傳多樣性分析[J]. 海洋與湖沼，2010，41（4）：530-537.

[17]李思發(fā). 魚類繁育群體遺傳性能的保護[J]. 水產(chǎn)學報，1988，12（3）：283-290.

[18]Franklin I R. Evolutionary change in small populations[C]//Soule M E，Wilcox B A. Conservation biology：An evolutionary-ecological perspective. Sunderland：Sinauer Associate，1980：135-150.endprint