微孔板法測定功能性飲料中的維生素B12

張艷 王駿等

摘 要：

通過樣品處理比較試驗(yàn)、色素影響評價(jià)、回收率試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)，得到了微孔板法測定功能性飲料中維生素B12的有效方法。經(jīng)測定，該方法測定限可達(dá)到0.005 μg/L，1.0、2.0、20.0 μg/L三個(gè)梯度水平的加標(biāo)回收率為94.4%～101.8%，實(shí)際樣品測定中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35%～4.34%（n=6），靈敏度和重復(fù)性很高，可用于測定功能性飲料中微量的維生素B12。

關(guān)鍵詞：微孔板法；測定；功能性飲料；維生素B12

中圖分類號：TS275.4+TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2014）04-0110-04

功能性飲料是應(yīng)特定人群的營養(yǎng)需求，通過添加維生素、礦物質(zhì)等功能因子制作的飲品，屬于特殊用途飲料類[1]，具有一定的保健功能。功能性飲料常添加各種維生素，如：煙酰胺、肌醇、維生素B6、維生素B12等[2，3]。其中，維生素B12能促進(jìn)紅細(xì)胞形成，參與人體內(nèi)碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝，可維護(hù)人體神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能[4，5]，是功能性飲料中經(jīng)常添加、極為重要的有效成分之一。

維生素B12測定方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)分析法和微生物法[6]。維生素B12在功能飲料中的添加量通常為0.8～20.0 μg/L，酶聯(lián)免疫吸附法（檢測限3.9 μg/kg）[7]、高效液相色譜-紫外法（檢測限1.0～4.4 μg/kg）[8，9]等化學(xué)分析法很難準(zhǔn)確測定其含量；而原子吸收分光光度法（檢測限5.0 ng/L）[10]、高效液相色譜-熒光光度法（檢測限0.1 μg/L）[11]雖然有較高的靈敏度，但往往因功能性飲料基質(zhì)復(fù)雜，樣品凈化難監(jiān)控，對儀器測定干擾大，從而影響維生素B12的測定結(jié)果[6]。

微生物測定法靈敏度高，檢測限可達(dá)到0.01 μg/L[12]，是進(jìn)行微量維生素B12測定的理想方法。但微生物法操作繁瑣、耗時(shí)長[6]，且實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性受微生物菌株活力、所用器皿清潔度、試驗(yàn)人員操作的影響較大[13，14]，亟需現(xiàn)代化的手段加以改善，以便廣泛應(yīng)用。為此，本試驗(yàn)用與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)測試原理相同的維生素B12測定試劑盒對功能性飲料中的維生素B12進(jìn)行測定[15]，并通過試驗(yàn)對其前處理方法、準(zhǔn)確性、精密度進(jìn)行評定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試樣為5種市售功能性飲料，維生素B12標(biāo)識質(zhì)量濃度分別為0.8、1.0、11.0、12.0、20.0 μg/L；維生素B12測定試劑盒[包括萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmannii）包被的96孔微孔板、維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品干粉、測試用培養(yǎng)基干粉、無菌蒸餾水、微孔板架]，德國IFP公司；微量移液器（100、200 μL及1 mL），德國Eppendorf公司；0.2 μm水相濾膜。

1.2 儀器與設(shè)備

xMark型酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司（精度0.001）；SHP-250型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司[（36±0.5）℃]；超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY公司；水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 測試用培養(yǎng)基的配制 在維生素B12測試用培養(yǎng)基貯存瓶中加入10 mL無菌水，密封混勻后95℃水浴5 min，期間振蕩混勻2次。水浴后迅速冷卻至室溫，用無菌濾膜過濾后備用。

1.3.2 樣品的預(yù)處理 用無菌濾膜過濾后，根據(jù)試劑盒說明對樣品濾液進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)=標(biāo)識質(zhì)量濃度÷0.06×40（注：因處理過程中未對試樣進(jìn)行40倍稀釋定容，需乘以40以糾正稀釋倍數(shù)計(jì)算）。

95℃水浴加熱組在過濾前于95℃水浴加熱30 min，期間振蕩混勻5次，水浴后迅速冷卻至室溫。

1.3.3 梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 按試劑盒說明配制維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品工作液，用無菌水對標(biāo)準(zhǔn)品原液進(jìn)行梯度稀釋，得到10%、20%、30%、40%、60%五個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對應(yīng)的維生素B12質(zhì)量濃度分別為0.3、0.6、0.9、1.2、1.8 μg/L。

1.3.4 測定步驟 測定在超凈工作臺(tái)的無菌環(huán)境中進(jìn)行。將適量微孔板條固定在微孔板架上，在每個(gè)微孔中先加入測試用培養(yǎng)基150 μL，再加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品稀釋液150 μL，空白對照、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品稀釋液各做3個(gè)平行；加樣完畢后，用配套黏合箔充分密封微孔板條，置于36℃培養(yǎng)箱中孵育44～48 h。

孵育完畢后，壓實(shí)黏合箔上下顛倒微孔板3 min混勻，輕輕撕開黏合箔，除去氣泡，在630 nm下讀取吸光值A(chǔ)630。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與含量計(jì)算

以維生素B12質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)630為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。根據(jù)得到的公式計(jì)算各微孔對應(yīng)的維生素B12質(zhì)量濃度。試樣中維生素B12質(zhì)量濃度的計(jì)算公式如下：

C=Cxf40

式中：C為試樣中維生素B12質(zhì)量濃度，單位μg/L；Cx為微孔對應(yīng)的維生素B12質(zhì)量濃度，單位μg/L；f為樣品稀釋倍數(shù)；40為稀釋定容的糾正參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 試樣預(yù)處理方法比較

為評價(jià)95℃水浴處理對功能性飲料中維生素B12測定的影響，設(shè)計(jì)了試樣1的95℃水浴加熱組，與無加熱處理組的測定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。試樣1的95℃水浴加熱組與無加熱處理組6次平行測定的平均值分別為2.221、2.230 μg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.29%，在測定誤差允許的范圍內(nèi)[17]，可忽略水浴加熱對測定結(jié)果的影響。

2.2 試樣中色素對測定結(jié)果的影響評價(jià)

功能性飲料的5個(gè)試樣分別為淡紫色、無色、明黃色、淡黃色和橘紅色的液體，而液體培養(yǎng)基為淡黃色。肉眼可見的顏色波長范圍，橙色為597～622 nm，紅色為622～770 nm[18]，而試樣最終測定使用630 nm，因此需通過試驗(yàn)評價(jià)試樣中色素對測定結(jié)果的影響。endprint

將5個(gè)試樣分別稀釋80、80、500、500和1 200倍，取各試樣相應(yīng)倍數(shù)稀釋液和測試用培養(yǎng)基以1∶1的比例混勻，并測定A630，測試用培養(yǎng)基與無菌水的1∶1混合液作為空白對照，得到5個(gè)試樣稀釋液的A630分別為-0.003、-0.001、0.000、-0.002、0.001。而在維生素B12測定過程中，5個(gè)試樣稀釋液的A630在0.259～0.665之間，可見試樣本身所含色素對最終A630的影響均小于1.2%，在酶標(biāo)儀的測定誤差范圍內(nèi)可以忽略不計(jì)。因此，功能性飲料無需進(jìn)行色素去除就可用微孔板法測定維生素B12。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與分析

以維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)630為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得曲線方程Y=-0.3245X3+0.919X2-0.1604X+0.0958（相關(guān)系數(shù)R2=1.000）在0.3～1.8 μg/L范圍內(nèi)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度良好（圖1）。

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

對試樣1進(jìn)行1.0、2.0、20.0 μg/L三個(gè)梯度水平的加標(biāo)回收率試驗(yàn)，平行測定6次，結(jié)果（表2）顯示，三個(gè)梯度的加標(biāo)回收率為94.4%～101.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～4.9%，精密度滿足<21%[17]的要求。該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，結(jié)果可靠，可滿足功能飲料中維生素B12含量的測定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

對5個(gè)試樣進(jìn)行6次平行測定，結(jié)果（表3）顯示，5個(gè)功能性飲料的測定值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35%～4.34%，均在5.0%之內(nèi)，符合<21%[17]的要求。測定重復(fù)性好，可滿足功能性飲料中維生素B12實(shí)際測定的要求。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmannii）對維生素B12的特異性和靈敏性，采用微孔板法測定功能性飲料中的維生素B12。由于測定用培養(yǎng)基中不含維生素B12，微生物生長產(chǎn)生的吸光值同標(biāo)準(zhǔn)溶液及未知待測溶液中維生素B12的含量相對應(yīng)[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，加熱處理和基質(zhì)色素不影響測定結(jié)果，試驗(yàn)操作簡便；所得標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為1.000，擬合程度良好；加標(biāo)回收率為94.4%～101.8%，實(shí)際樣品測定時(shí)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35%～4.34%（n=6），方法的精密度、準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好；該方法測定限可達(dá)到0.005 μg/L，靈敏度高，能滿足功能性飲料中微量維生素B12測定對準(zhǔn)確度的要求。

微孔板技術(shù)改善了微生物測定方法的不足之處[14，19]，因生產(chǎn)工藝規(guī)范，保證了均一的菌株接種量和生長活力，從而提高了試驗(yàn)的精密度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性；且微孔板的設(shè)計(jì)模式使試驗(yàn)操作更加簡便，提高了工作效率。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. GB10789-2007飲料通則[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

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[8] Campos-Gimenez Esther，F(xiàn)ontannaz Patric，Trisconi Marie-Jose，et al.Determination of vitamin B12 in food products by liquid chromatography/UV detection with immunoaffinity extraction：single-laboratory validation[J].Journal of AOAC International，2008，91（4）：786-793.

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[18]馬文蔚等著. 物理學(xué)（下冊） [M]. 第5版. 北京： 高等教育出版社， 2006： 161-179.

[19]張旺， 鄒志飛， 袁慕云. 微孔板試劑盒法檢測嬰幼兒配方奶粉中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)[J]. 中國乳品工業(yè)， 2013， 41（2）：59-64.endprint

將5個(gè)試樣分別稀釋80、80、500、500和1 200倍，取各試樣相應(yīng)倍數(shù)稀釋液和測試用培養(yǎng)基以1∶1的比例混勻，并測定A630，測試用培養(yǎng)基與無菌水的1∶1混合液作為空白對照，得到5個(gè)試樣稀釋液的A630分別為-0.003、-0.001、0.000、-0.002、0.001。而在維生素B12測定過程中，5個(gè)試樣稀釋液的A630在0.259～0.665之間，可見試樣本身所含色素對最終A630的影響均小于1.2%，在酶標(biāo)儀的測定誤差范圍內(nèi)可以忽略不計(jì)。因此，功能性飲料無需進(jìn)行色素去除就可用微孔板法測定維生素B12。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與分析

以維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)630為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得曲線方程Y=-0.3245X3+0.919X2-0.1604X+0.0958（相關(guān)系數(shù)R2=1.000）在0.3～1.8 μg/L范圍內(nèi)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度良好（圖1）。

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

對試樣1進(jìn)行1.0、2.0、20.0 μg/L三個(gè)梯度水平的加標(biāo)回收率試驗(yàn)，平行測定6次，結(jié)果（表2）顯示，三個(gè)梯度的加標(biāo)回收率為94.4%～101.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～4.9%，精密度滿足<21%[17]的要求。該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，結(jié)果可靠，可滿足功能飲料中維生素B12含量的測定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

對5個(gè)試樣進(jìn)行6次平行測定，結(jié)果（表3）顯示，5個(gè)功能性飲料的測定值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35%～4.34%，均在5.0%之內(nèi)，符合<21%[17]的要求。測定重復(fù)性好，可滿足功能性飲料中維生素B12實(shí)際測定的要求。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmannii）對維生素B12的特異性和靈敏性，采用微孔板法測定功能性飲料中的維生素B12。由于測定用培養(yǎng)基中不含維生素B12，微生物生長產(chǎn)生的吸光值同標(biāo)準(zhǔn)溶液及未知待測溶液中維生素B12的含量相對應(yīng)[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，加熱處理和基質(zhì)色素不影響測定結(jié)果，試驗(yàn)操作簡便；所得標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為1.000，擬合程度良好；加標(biāo)回收率為94.4%～101.8%，實(shí)際樣品測定時(shí)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35%～4.34%（n=6），方法的精密度、準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好；該方法測定限可達(dá)到0.005 μg/L，靈敏度高，能滿足功能性飲料中微量維生素B12測定對準(zhǔn)確度的要求。

微孔板技術(shù)改善了微生物測定方法的不足之處[14，19]，因生產(chǎn)工藝規(guī)范，保證了均一的菌株接種量和生長活力，從而提高了試驗(yàn)的精密度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性；且微孔板的設(shè)計(jì)模式使試驗(yàn)操作更加簡便，提高了工作效率。

參 考 文 獻(xiàn)：

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[3] 文劍. 功能飲料市場現(xiàn)狀及未來發(fā)展方向[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2007， 33（4）：101-106.

[4] 楊鳴. 葉酸、維生素B12、同型半胱氨酸和K-ras基因相互作用與胰腺癌關(guān)系的研究[D]. 上海：第二軍醫(yī)大學(xué)， 2011.

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[6] 崔明， 楊大進(jìn)， 魯杰， 等. VB12檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2011， 37（4）：166-171.

[7] Sharma R， Rajput Y S， Dogra G， et al. Estimation of vitamin B12 by ELISA and its status in milk[J]. Milchwissenschaft， 2007， 62（2）：127-130.

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[9] Marley E C， MacKay E， Young G. Characterization of vitamin B12 immunoaffinity columns and method development for determination of vitamin B12 in a range of foods， juices and pharmaceutical products using immunoaffinity clean-up and high performance liquid chromatography with UV detection[J]. Food Additives & Contaminants， 2009， 26（3）：282-288.

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[16]唐靚， 李躍中， 王晗， 等. 國標(biāo)《食品中葉酸的測定》的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2009， 19（7）： 1682-1683.

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將5個(gè)試樣分別稀釋80、80、500、500和1 200倍，取各試樣相應(yīng)倍數(shù)稀釋液和測試用培養(yǎng)基以1∶1的比例混勻，并測定A630，測試用培養(yǎng)基與無菌水的1∶1混合液作為空白對照，得到5個(gè)試樣稀釋液的A630分別為-0.003、-0.001、0.000、-0.002、0.001。而在維生素B12測定過程中，5個(gè)試樣稀釋液的A630在0.259～0.665之間，可見試樣本身所含色素對最終A630的影響均小于1.2%，在酶標(biāo)儀的測定誤差范圍內(nèi)可以忽略不計(jì)。因此，功能性飲料無需進(jìn)行色素去除就可用微孔板法測定維生素B12。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與分析

以維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)630為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得曲線方程Y=-0.3245X3+0.919X2-0.1604X+0.0958（相關(guān)系數(shù)R2=1.000）在0.3～1.8 μg/L范圍內(nèi)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度良好（圖1）。

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

對試樣1進(jìn)行1.0、2.0、20.0 μg/L三個(gè)梯度水平的加標(biāo)回收率試驗(yàn)，平行測定6次，結(jié)果（表2）顯示，三個(gè)梯度的加標(biāo)回收率為94.4%～101.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～4.9%，精密度滿足<21%[17]的要求。該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，結(jié)果可靠，可滿足功能飲料中維生素B12含量的測定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

對5個(gè)試樣進(jìn)行6次平行測定，結(jié)果（表3）顯示，5個(gè)功能性飲料的測定值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35%～4.34%，均在5.0%之內(nèi)，符合<21%[17]的要求。測定重復(fù)性好，可滿足功能性飲料中維生素B12實(shí)際測定的要求。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmannii）對維生素B12的特異性和靈敏性，采用微孔板法測定功能性飲料中的維生素B12。由于測定用培養(yǎng)基中不含維生素B12，微生物生長產(chǎn)生的吸光值同標(biāo)準(zhǔn)溶液及未知待測溶液中維生素B12的含量相對應(yīng)[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，加熱處理和基質(zhì)色素不影響測定結(jié)果，試驗(yàn)操作簡便；所得標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為1.000，擬合程度良好；加標(biāo)回收率為94.4%～101.8%，實(shí)際樣品測定時(shí)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35%～4.34%（n=6），方法的精密度、準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好；該方法測定限可達(dá)到0.005 μg/L，靈敏度高，能滿足功能性飲料中微量維生素B12測定對準(zhǔn)確度的要求。

微孔板技術(shù)改善了微生物測定方法的不足之處[14，19]，因生產(chǎn)工藝規(guī)范，保證了均一的菌株接種量和生長活力，從而提高了試驗(yàn)的精密度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性；且微孔板的設(shè)計(jì)模式使試驗(yàn)操作更加簡便，提高了工作效率。

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