劉中娟，宋桂瑜，趙召霞，張 麟，秦緒珍，張瑞麗，韓慧娟，郭子建

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科， 北京 1007302石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科， 石家莊 050021

·論 著·

卵巢癌患者CA125水平對細(xì)胞免疫功能的影響

劉中娟1，宋桂瑜1，趙召霞2，張 麟1，秦緒珍1，張瑞麗1，韓慧娟1，郭子建1

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科， 北京 1007302石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科， 石家莊 050021

目的 體外檢測卵巢癌患者血中CA125對細(xì)胞免疫功能的影響。方法 收集2012年5月至2013年6月北京協(xié)和醫(yī)院符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的卵巢癌患者58例，按CA125濃度分為3組；同時(shí)收集良性婦科疾病患者20例及體檢正常的健康者20名作為對照。應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附法、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)等實(shí)驗(yàn)，觀察體外刺激健康人淋巴細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)的能力，判斷CA125對機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的影響。結(jié)果在卵巢癌患者中，隨CA125水平升高，淋巴細(xì)胞絕對值及百分比值呈逐漸下降趨勢。高濃度CA125卵巢癌患者的血清與植物血凝素共同刺激健康者混合淋巴細(xì)胞后，培養(yǎng)上清液中IFN-γ的含量[(36.16±16.89)ng/ml]較陽性對照組和低濃度CA125組[分別為(45.68±18.01)和(46.22±19.30)ng/ml]顯著降低(P<0.05)；ELISPOT結(jié)果顯示高濃度和中濃度CA125(斑點(diǎn)數(shù)均值分別為108.2和371.6)對細(xì)胞免疫抑制功能與健康對照組和良性疾病組(斑點(diǎn)數(shù)均值分別為573.0和523.0)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；而去除血清中CA125后，對細(xì)胞免疫抑制作用明顯減弱。結(jié)論 卵巢癌患者體內(nèi)的CA125水平與淋巴細(xì)胞的數(shù)量、活性及其產(chǎn)生細(xì)胞因子的活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。CA125除作為與卵巢癌相關(guān)的標(biāo)志物外，還可能是一種細(xì)胞免疫抑制因子。

CA125；卵巢癌；淋巴細(xì)胞；細(xì)胞因子；γ-干擾素

MedJPUMCH,2014,5(3):273-277

全球范圍內(nèi)，卵巢癌是女性死亡率最高的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。由于其發(fā)病比較隱匿且無明顯的臨床癥狀，75%以上的卵巢癌患者被診斷時(shí)已是晚期，錯(cuò)過了治療的最佳時(shí)期，使得晚期卵巢癌患者5 年生存率僅15 %～20 %，且手術(shù)和化療后復(fù)發(fā)率高[1- 2]。許多臨床研究表明卵巢癌患者體內(nèi)均有CA125不同程度的升高，同時(shí)多數(shù)卵巢癌患者體內(nèi)可能存在免疫功能低下的現(xiàn)象[3]。近年有文獻(xiàn)報(bào)道，I型-凝集素Siglec- 9已經(jīng)被確定為CA125的受體之一[4]，它主要表達(dá)在約30%～40%的具有CD16+/CD56dim標(biāo)志的NK細(xì)胞、20%～30%的B細(xì)胞、95%以上的單核細(xì)胞和部分淋巴細(xì)胞上。外周血免疫細(xì)胞和卵巢癌患者的腹腔液中均發(fā)現(xiàn)了I型-凝集素Siglec- 9[5]。它們是否與卵巢癌患者的免疫功能低下有關(guān)尚未見研究報(bào)道。本研究目的是通過比較卵巢癌患者不同水平的CA125對免疫抑制功能的影響，研究CA125在卵巢癌患者細(xì)胞免疫功能中的作用。

對象和方法

對象及分組

2012年5月至2013年6月北京協(xié)和醫(yī)院收治的門診及住院卵巢癌患者58例，所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)明確診斷，且未接受任何治療?；颊吣挲g范圍38～83歲。組織病理學(xué)結(jié)果顯示組織學(xué)類型、分級及臨床分期如下：(1)組織學(xué)類型：漿液性囊腺癌29例，黏液性囊腺癌16例，子宮內(nèi)膜樣癌13例；(2)臨床分期：采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)2000的標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ和Ⅱ期共17例，Ⅲ和Ⅳ期共41例；(3)組織學(xué)分級：G1級15例，G2、G3級43例。

58例卵巢癌患者按血清CA125濃度分為3組：高濃度組血清CA125水平均大于3000 U/ml，共26例，平均年齡59歲，平均CA125含量為5032 U/ml；中濃度組血清CA125水平為1000～3000 U/ml，共19例，平均年齡52歲，平均CA125含量為1559 U/ml；低濃度組血清CA125水平為300～1000 U/ml，共13例，平均年齡54歲，平均CA125含量為551 U/ml。

健康對照組 20名，來自北京協(xié)和醫(yī)院體檢中心體檢合格的正常健康婦女，平均年齡45歲，平均血清CA125含量11 U/ml，心、肺、肝、腎等器官正常，無婦產(chǎn)科疾病。良性疾病組20例，來自北京協(xié)和醫(yī)院收治的婦科門診和住院患者，臨床診斷為宮頸炎、子宮肌瘤等非卵巢癌的婦科疾病患者，平均年齡41歲，平均血清CA125含量為26 U/ml。

主要試劑和儀器

主要試劑：淋巴細(xì)胞分離液由北京博邁斯生物科技有限公司提供；植物血凝素(phytohemagglutinin, PHA)由北京達(dá)科為科技有限公司提供；1640細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)由美國SIGMA公司提供；γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunospot, ELISPOT)、IFN-γ的酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒由北京達(dá)科為科技有限公司提供。CA125檢測試劑由羅氏公司提供。

主要儀器：德國艾迪公司ELISPOT圖像分析儀 (AID iSpot Reader)；羅氏Cobas E601全自動免疫分析儀；美國Precision Scientific 5410型CO2培養(yǎng)箱；西門子ADVIA2120全自動血液分析儀；瑞士TECAN sunrise酶標(biāo)儀。

實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)中所用淋巴細(xì)胞均為健康人新鮮EDTA抗凝全血，通過體外淋巴細(xì)胞分離方法分離得到；血清CA125檢測方法為電化學(xué)發(fā)光(羅氏Cobas E601檢測儀及配套試劑檢測)；淋巴細(xì)胞的數(shù)量和百分比采用過氧化物酶法。對混合淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ的能力通過ELISPOT和ELISA技術(shù)檢測。

ELISPOT實(shí)驗(yàn)

在超凈臺內(nèi)無菌操作，采用淋巴細(xì)胞分離液分離出健康人的新鮮混合淋巴細(xì)胞，按說明書要求用1640細(xì)胞培養(yǎng)液(加10%胎牛血清)調(diào)整淋巴細(xì)胞的濃度為1.0×106個(gè)/ml，每孔取100 μl細(xì)胞懸液加入預(yù)包被有INF-γ抗體的PVDF板條孔中，進(jìn)行體外培養(yǎng)約20 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)有空白對照孔(陰性對照)、單純PHA刺激淋巴細(xì)胞孔(陽性對照)、PHA和含有稀釋到不同水平CA125的血清共同刺激淋巴細(xì)胞孔(實(shí)驗(yàn)孔)。培養(yǎng)結(jié)束后按照說明書操作完成裂解細(xì)胞、洗板、檢測抗體孵育、洗板、酶聯(lián)親和素孵育、洗板、顯色、終止顯色、ELISPOT 板斑點(diǎn)計(jì)數(shù)等操作步驟。

ELISA實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞制備同前述ELISPOT實(shí)驗(yàn)，每孔取200 μl細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，進(jìn)行體外培養(yǎng)約48 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)有空白對照孔(陰性對照)、單純PHA刺激淋巴細(xì)胞孔(陽性對照)、PHA和含有不同水平CA125的血清共同刺激淋巴細(xì)胞孔(實(shí)驗(yàn)孔)。培養(yǎng)結(jié)束后小心吸取培養(yǎng)上清100 μl/ml，按照人IFN-γ預(yù)包被ELISA 試劑盒說明書操作，檢測培養(yǎng)上清液中IFN-γ濃度。

血清CA125去除方法

應(yīng)用羅氏公司提供的CA125檢測試劑盒，依據(jù)1個(gè)單位CA125加入0.9 μl生物素化單克隆抗體和0.65 μl包被鏈霉親和素的磁珠微粒計(jì)算相應(yīng)的試劑量，按照抗原抗體反應(yīng)形成磁珠微粒-鏈酶親和素-生物素-anti-CA125-CA125抗原復(fù)合物，高速瞬時(shí)離心后吸取上層血清，即得到去除CA125抗原的血清，再次進(jìn)行CA125檢測。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

不同濃度CA125卵巢癌患者的外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量和比率

高濃度CA125組卵巢癌患者的免疫狀態(tài)明顯低于正常水平，即其淋巴細(xì)胞絕對值及百分比均較對照組降低。在卵巢癌患者中，隨著CA125水平的升高，淋巴細(xì)胞絕對值及百分比值呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(表1)。

表 1 不同濃度CA125卵巢癌患者外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量和比率

與健康對照組和良性疾病組比較，*P<0.05

不同濃度CA125卵巢癌患者血清對淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的影響

單獨(dú)用PHA刺激(陽性對照)后混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的含量為(45.68±18.01)ng/ml，分別采用高濃度(3000 U/ml)、中濃度(1000 U/ml)和低濃度(300 U/ml)CA125與PHA共同作用于淋巴細(xì)胞，混合培養(yǎng)后上清液中IFN-γ的含量分別為(36.16±16.89)、(39.15±8.18)和(46.22±19.30)ng/ml。高濃度組與陽性對照組和低濃度組比較，IFN-γ含量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

不同濃度CA125對細(xì)胞免疫抑制功能的影響

為排除血清中可能存在的其他因素對實(shí)驗(yàn)的影響，本研究收集確診的CA125<35 U/ml卵巢癌患者血清， 應(yīng)用ELISPOT進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組檢測5次取平均值作為斑點(diǎn)數(shù)。結(jié)果顯示單純PHA刺激組、健康對照組、良性疾病組以及CA125<35 U/ml卵巢癌患者組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其斑點(diǎn)數(shù)分別為530.5、573.0、523.0和554.4。提示健康人和患者的血清中可能存在的其他成分對細(xì)胞免疫抑制功能無顯著影響。

為觀察不同濃度CA125對細(xì)胞免疫是否有抑制作用，本研究將不同濃度CA125的卵巢癌患者血清和PHA共同刺激健康人混合淋巴細(xì)胞，進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)，每組平行操作5次取斑點(diǎn)數(shù)平均值。在排除其他因素影響的情況下，通過斑點(diǎn)計(jì)數(shù)和計(jì)算出的抑制率可以看出血清中的CA125對細(xì)胞免疫功能有抑制作用，且高濃度和中濃度CA125對免疫抑制功能與健康對照組和良性疾病組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2，圖1)。

卵巢癌患者血清去除相應(yīng)CA125后的各種免疫相關(guān)指標(biāo)檢測

對不同濃度CA125卵巢癌患者血清經(jīng)相應(yīng)的處理后，去除CA125的血清進(jìn)行免疫抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示去除CA125后免疫抑制作用明顯減弱(表3)。

表 2 不同濃度CA125對培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞免疫抑制作用比較

ELISPOT：酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)；與健康對照組和良性疾病組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖 1 不同濃度CA125卵巢癌患者血清對T細(xì)胞激活的抑制作用(ELISPOT結(jié)果)A.對照組；B.高濃度CA125組；C.中濃度CA125組；D.低濃度CA125組

病例CA125(U/ml)抑制率(%)γ-干擾素(ng/ml)原濃度去除后原濃度去除后原濃度去除后13106309.986.284.837.344.623185320.878.140.08.310.231727389.387.484.954.055.5

討 論

大量的臨床實(shí)踐顯示，絕大多數(shù)卵巢癌患者體內(nèi)有CA125的表達(dá)，尤其是中晚期患者CA125有極高水平表達(dá)。因此，CA125是目前比較理想的用于卵巢癌輔助診斷的血清標(biāo)志物，也是卵巢癌治療療效和治療后腫瘤是否復(fù)發(fā)的重要監(jiān)測手段。但CA125的臨床價(jià)值可能不僅僅如此，最近有文獻(xiàn)報(bào)道，Ⅰ型- 凝集素Siglec- 9已經(jīng)被確定為CA125的受體之一[4]，其主要表達(dá)在NK細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞上。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可利用多種機(jī)制逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。有效的免疫監(jiān)視很大程度上依賴于免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別，研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞表面的MUC16與CA125結(jié)合阻止了NK細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞的有效識別，使卵巢癌細(xì)胞得以逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視[6- 7]。在早期妊娠婦女，其體內(nèi)CA125可以和相應(yīng)受體結(jié)合，機(jī)體繼而產(chǎn)生對早期受精卵的免疫抑制，促進(jìn)受精卵的著床和正常妊娠的進(jìn)行[8- 9]。由此推測，在卵巢癌患者體內(nèi)，高濃度CA125結(jié)合相應(yīng)的受體可抑制腫瘤免疫細(xì)胞活性，使腫瘤發(fā)生免疫逃逸。因此，CA125在相關(guān)腫瘤中的作用值得深入研究和探討。

與其他惡性腫瘤一樣，絕大多數(shù)卵巢癌患者存在免疫功能低下的現(xiàn)象[10- 11]。本研究顯示，高濃度CA125卵巢癌患者的淋巴細(xì)胞數(shù)量及淋巴細(xì)胞比率均降低，免疫功能偏離正常狀態(tài)。為探討卵巢癌患者免疫功能低下與CA125是否相關(guān)，本研究采用了兩種不同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一種方法采用不同CA125濃度的卵巢癌患者血清與健康人混合淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量；另一種方法采用ELISPOT技術(shù)檢測不同CA125濃度的卵巢癌患者血清對混合淋巴細(xì)胞的免疫抑制程度。結(jié)果顯示，高濃度CA125卵巢癌患者的血清與PHA共同刺激混合淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)上清中IFN-γ含量較對照組顯著降低，尤其是高濃度和中濃度CA125卵巢癌患者血清對混合淋巴細(xì)胞免疫抑制作用顯著增加，且卵巢癌患者CA125的濃度越高，對細(xì)胞免疫抑制作用越強(qiáng)。

為排除血清中可能存在的其他因素對實(shí)驗(yàn)的影響，本研究收集確診的CA125<35 U/ml卵巢癌患者血清，應(yīng)用ELISPOT技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞免疫功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示斑點(diǎn)數(shù)在單純PHA刺激組(陽性對照)、對照組(健康組和良性疾病組)以及CA125<35 U/ml卵巢癌患者組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示卵巢癌患者血清中可能存在的其他成分對細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)無顯著影響，CA125可能是導(dǎo)致卵巢癌患者免疫功能低下的原因之一。為進(jìn)一步了解CA125對細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的影響，本研究對高濃度CA125血清用免疫學(xué)方法去除，處理后血清CA125濃度均在700 U/ml以下，再對細(xì)胞免疫功能進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量有所上升。ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低水平的CA125對細(xì)胞免疫抑制影響明顯降低，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CA125參與了卵巢癌患者的部分細(xì)胞免疫抑制功能。

Pfisterer等[12]報(bào)道了CA125單抗藥物用于晚期卵巢癌鞏固治療的隨機(jī)對照研究，發(fā)現(xiàn)該藥物能有效引起CA125的特異性免疫反應(yīng)，有很好的治療前景。盡管目前有限的臨床試驗(yàn)尚未顯示出針對CA125靶向治療的明確療效，但可以相信CA125靶向治療將為陷于困境的卵巢癌治療現(xiàn)狀開啟一線新的希望。因此通過對CA125的分子自身結(jié)構(gòu)及其與淋巴細(xì)胞間的作用機(jī)制等多方面研究，期望能夠更多地發(fā)現(xiàn)CA125在卵巢癌各階段治療中的潛在價(jià)值，可為CA125更好地在臨床上應(yīng)用提供更多依據(jù)。針對CA125對機(jī)體的免疫抑制作用，可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)一步探索，最直接的辦法是過濾去除體內(nèi)的CA125，同時(shí)結(jié)合常規(guī)腫瘤治療措施；也可利用去糖基化的物質(zhì)對CA125進(jìn)行處理，或人工制備CA125抗體，中和過量的CA125，抑制其功能的發(fā)揮等。鑒于兩者的密切關(guān)聯(lián)，從免疫方面來尋求對卵巢癌的治療將會是一個(gè)很有希望取得突破性進(jìn)展的途徑，但其具體作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明卵巢癌患者體內(nèi)的CA125水平與淋巴細(xì)胞的數(shù)量、活性及其產(chǎn)生細(xì)胞因子的活性呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系，這將對卵巢癌患者免疫狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)測、治療、預(yù)后、復(fù)發(fā)評價(jià)等起到很好的指導(dǎo)作用，也可能使CA125成為卵巢癌患者治療的靶向因子。

致謝：北京協(xié)和醫(yī)院感染科實(shí)驗(yàn)室張麗帆醫(yī)生在酶免疫斑點(diǎn)檢測中給予了幫助，特此致謝

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LIU Zhong-juan1, SONG Gui-yu1, ZHAO Zhao-xia2, ZHANG Lin1, QIN Xu-zhen1, ZHANG Rui-li1,HAN Hui-juan1, GUO Zi-jian1

1Department of Clinical Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Beijing 100730, China2Department of Clinical Laboratory, the Fifth Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050021, China

GUO Zi-jian Tel: 010-69159743, E-mail:guozj@pumch.cn

Objective To detect the effects of CA125 on cellular immune function of the ovarian cancer (OC) patientsinvitro. Methods Totally 58 patients with confirmed OC in our hospital from May 2012 to June 2013 were divided into three groups based on the CA125 levels. Meanwhile, 20 healthy subjects(control group) and 20 patients with benign gynecological diseases (benign diseases group) were also included. Theinvitroability of healthy human lymphocytes in secreting interferon-γ (IFN-γ) under the stimulation of phytohemagglutinin(PHA) was observed by cell culture, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and enzyme-linked immunospot (ELISPOT). Results In OC patients, the count and percentage of lymphocytes decreased gradually with elevated levels of CA125. The concentration of IFN-γ in the supernatant of cultured lymphocytes from healthy individuals decreased significantly under the stimulation of PHA and high concentration of CA125[(36.16±16.89)ng/ml]compared with that of PHA alone [(45.68±18.01)ng/ml] or PHA and low concentration of CA125 [(46.22±19.30)ng/ml](bothP<0.05). Compared with the control group(spots number 573.0) and the benign diseases group(spots number 523.0), the high(spots number 108.2) and intermediate(spots number 371.6) concentration of CA125 had significant inhibitory effect on the cellular immune system, as detected by ELISPOT (P<0.01,P<0.05, respectively). After removal of CA125 from the serum by antibody, the inhibitory effect was weakened significantly. Conclusions The concentration of CA125 in OC patient is negatively correlated with the number and activity of lymphocytes, in particular their abilities in releasing cytokines. CA125 is not only a biomarker of OC but also may serve as an immunosuppressive factor.

CA125；ovarian cancer；lymphocyte；cytokine; interferon-γ

郭子建 電話：010-69159743，E-mail：guozj@pumch.cn

R3- 3

A

1674-9081(2014)03-0273-05

10.3969/j.issn.1674-9081.2014.03.006

2014- 04- 04)