禹松林，周偉燕，楊睿悅，李紅霞，張順利，張?zhí)鞁?，趙海建，張傳寶，王 抒，陳文祥，董 軍

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科， 北京 1007302衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心生化室， 北京 1007303衛(wèi)生部北京醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所生化室， 北京 100730

·論 著·

老年2型糖尿病患者血清膽固醇酯脂肪酸檢測(cè)

禹松林1，周偉燕2，楊睿悅3，李紅霞3，張順利2，張?zhí)鞁?，趙海建2，張傳寶2，王 抒3，陳文祥2，董 軍3

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科， 北京 1007302衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心生化室， 北京 1007303衛(wèi)生部北京醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所生化室， 北京 100730

目的 探討老年2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者血清膽固醇酯脂肪酸及相關(guān)生化指標(biāo)變化情況。方法 研究納入2012年8月至12月北京醫(yī)院老年體檢志愿者145例(年齡≥60歲)，包括確診為2型DM患者(DM組)73例和健康對(duì)照者(對(duì)照組)72名，抽取空腹靜脈血。用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血清11種主要膽固醇酯脂肪酸，計(jì)算各脂肪酸脫氫酶及脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)酶活性；同時(shí)用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、載脂蛋白AI(apolipoprotein AI，ApoAI)、載脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)、超敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hsCRP)等生化指標(biāo)，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)、Logistic 回歸等方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果 DM組血清脂肪酸CE14∶0、CE16∶1和CE22∶6顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其他脂肪酸成分差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組相比，DM組Δ9-脂肪酸脫氫酶(Δ9-desaturase)活性顯著降低(P=0.001)；Logistic回歸分析顯示CE22∶6和Δ9-desaturase活性對(duì)預(yù)測(cè)DM患病風(fēng)險(xiǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；校正年齡、性別、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、TC、TG、 FPG因素影響后，與CE22∶6最低四分位數(shù)(CE22∶6≤0.47%)相比，最高四分位數(shù)(CE22∶6>0.68%)患DM的比值比為0.27(95%CI: 0.08～0.86，Wald值4.93，P<0.05)；與Δ9-desaturase活性最低四分位數(shù)(Δ9-desaturase活性≤0.12)相比，最高四分位數(shù)(Δ9-desaturase活性>0.17)患DM的比值比為0.06(95%CI: 0.01～0.22，Wald值17.39，P<0.01)。CE14∶0和CE20∶3與FPG呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.18、-0.17，P<0.05)；CE18∶0與BMI、TG呈顯著正相關(guān)(r=0.25、0.24，P<0.01)，而與HDL-C和ApoAI呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.39、-0.35，P<0.01)；CE20∶3與BMI的相關(guān)性最強(qiáng)(r=0.42，P<0.01)。結(jié)論 老年2型DM患者血清部分膽固醇酯脂肪酸降低，CE22∶6和Δ9-desaturase可能對(duì)2型DM具有保護(hù)作用，平衡脂肪酸攝入對(duì)防治2型DM具有重要意義。

脂肪酸；2型糖尿??；脂肪酸脫氫酶

MedJPUMCH,2014,5(3):264-269

隨著中國(guó)老齡化進(jìn)程的加速，糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成為一項(xiàng)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，Xu等[1]發(fā)表在JAMA上的文章顯示中國(guó)成人DM患病率已上升至 11.6%。實(shí)施有效的早期預(yù)防干預(yù)措施對(duì)防治DM至關(guān)重要。其中，飲食脂肪性質(zhì)與DM發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]，監(jiān)測(cè)DM患者血清脂肪酸含量變化對(duì)指導(dǎo)健康飲食、防治DM具有重要意義。研究指出血清膽固醇酯脂肪酸可反映過(guò)去數(shù)周飲食脂肪性質(zhì)，同時(shí)可反映攝食脂肪酸在脫氫酶和(或)碳鏈延長(zhǎng)酶作用下的內(nèi)源性轉(zhuǎn)換，與胰島素抵抗、糖耐量及2型DM相關(guān)[3- 4]。本研究通過(guò)比較2型DM患者和健康對(duì)照者血清中膽固醇酯脂肪酸含量的變化，同時(shí)分析血清脂肪酸與2型DM其他危險(xiǎn)因素的關(guān)系，以期對(duì)指導(dǎo)健康飲食、防治糖尿病提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

對(duì)象和方法

對(duì)象

2012年8月至12月北京醫(yī)院60歲以上老年體檢人群中招募73例DM患者作為DM組，其中男46例，女27例，平均年齡(69±6)歲。入選DM患者均依據(jù)《2010中國(guó)2型糖尿病防治指南》為2型DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，或者臨床已診斷為2型DM。同時(shí)在60歲以上體檢人群中選取年齡、性別相匹配的72名表觀健康者作為對(duì)照組，其中男45名，女27名，平均年齡(69±7)歲，均無(wú)DM病史。入選人群無(wú)心血管、高血壓等疾病，2個(gè)月內(nèi)未食用深海魚油等保健品。

儀器、試劑和血清樣品

本研究使用的主要儀器為L(zhǎng)C-MS/MS系統(tǒng)，由1200型高效液相色譜儀(Agilent，美國(guó))和API 4000 Triple Quadruple質(zhì)譜儀(AB SCIEX，美國(guó))組成；其他儀器包括MicroLab 500稀釋器(Hamilton，美國(guó))、XL- 90超速離心機(jī)(Beckman Coulter，美國(guó))和7180自動(dòng)生化分析儀(日立，日本)等。

脂肪酸測(cè)定中作參考標(biāo)準(zhǔn)的膽固醇酯脂肪酸購(gòu)自美國(guó)Nuchek Prep. Inc公司。色譜純乙腈、正己烷和異丙醇購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司，甲酸銨購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、載脂蛋白AI(apolipoprotein AI，ApoAI)、載脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)等試劑盒為日本Sekisui Medical Technologies公司產(chǎn)品?？崭寡?fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)和超敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hsCRP)等試劑盒為羅氏(Roche)公司產(chǎn)品。

血清膽固醇酯脂肪酸測(cè)定

血清膽固醇酯脂肪酸測(cè)定采用本實(shí)驗(yàn)室建立的LC-MS/MS法[5]，首先用異丙醇沉淀血清蛋白，之后將提取物進(jìn)行液質(zhì)分析，液相色譜采用Nova-Pak C18色譜柱(4 μm, 2.1 mm×150 mm)，流動(dòng)相為95% A相(異丙醇∶乙腈∶正己烷=55∶45∶15)和5% B相(含100 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液)，流速為0.3 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣1 μl。質(zhì)譜采用電噴霧離子源正離子下多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，以歸一化法進(jìn)行定量，共測(cè)定血清中11種主要膽固醇酯，包括CE14∶0、CE16∶0、CE16∶1、CE18∶0、CE18∶1、CE18∶2、CE18∶3、CE20∶3、CE20∶4、CE20∶5、CE22∶6。飽和脂肪酸(saturated fatty acids, SFA)=CE14∶0+CE16∶0+CE18∶0，單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids, MUFA)=CE16∶1+CE18∶1，多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)=CE18∶2+CE18∶3+CE20∶3+CE20∶4+CE20∶5+CE22∶6。

生化指標(biāo)測(cè)定

TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoAI、ApoB、FPG和hsCRP用7180自動(dòng)生化分析儀使用試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

脂肪酸相關(guān)酶活性測(cè)定

根據(jù)產(chǎn)物與其對(duì)應(yīng)的前體比率計(jì)算得出，Δ9-脂肪酸脫氫酶(Δ9-desaturase)活性=CE16∶1/CE16∶0，Δ6-脂肪酸脫氫酶(Δ6-desaturase)活性=CE18∶3/CE18∶2，Δ5-脂肪酸脫氫酶(Δ5-desaturase)活性=CE20∶4/CE20∶3，碳鏈延長(zhǎng)酶(elongase)活性=CE20∶3/CE18∶3。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SSPS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布樣本比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，非正態(tài)分布兩獨(dú)立樣本比較選用非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU)，對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的定量變量按四分位數(shù)分為四組，建立模型，用二元Logistic回歸和Wald檢驗(yàn)分析其與DM的相關(guān)性，用雙變量偏相關(guān)分析(Spearman相關(guān)分析)研究血清脂肪酸和其他生化指標(biāo)的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

DM組和對(duì)照組基本特征

DM組和對(duì)照組患者的年齡、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、 FPG、血脂指標(biāo)(TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoAI、ApoB)、hsCRP見表1。其中，DM組和對(duì)照組BMI、FPG、TC、LDL-C、TG、ApoB、hsCRP之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

DM組和對(duì)照組脂肪酸含量比較

本研究145例檢測(cè)對(duì)象血清脂肪酸含量多呈非正態(tài)分布，因此選用兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU)比較DM組和對(duì)照組脂肪酸含量。結(jié)果顯示DM組血清CE14∶0、CE16∶1、CE22∶6以及Δ9-desaturase活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其他各脂肪酸及總SFA、MUFA、PUFA等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表 1 DM組和對(duì)照組人群基本特征±s)

DM：糖尿??；BMI：體重指數(shù)；FPG：空腹血糖；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；TG：甘油三酯；ApoAI：載脂蛋白AI；ApoB：載脂蛋白B；hsCRP：超敏C反應(yīng)蛋白

進(jìn)一步用Logistic回歸和Wald檢驗(yàn)分析CE14∶0、CE16∶1、CE22∶6含量以及Δ9-desaturase活性，首先作為定量自變量直接帶入模型評(píng)估這4種指標(biāo)不同水平時(shí)2型DM的患病風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果顯示CE22∶6和Δ9-desaturase活性對(duì)預(yù)測(cè)2型DM患病風(fēng)險(xiǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Wald值=8.41,4.97；P<0.01, 0.05)。然后結(jié)合實(shí)際意義，將CE22∶6濃度及Δ9-desaturase活性根據(jù)四分位數(shù)分為4組，建立校正性別、年齡因素下的模型1，進(jìn)一步行Logistic回歸和Wald檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示：CE22∶6與最低四分位數(shù)(CE22∶6≤0.47%)相比，最高四分位數(shù)(CE22∶6>0.68%)患DM的比值比(odds ratio，OR)為0.27(95%CI：0.09～0.77，Wald值=5.95，P<0.05)；Δ9-desaturase活性與最低四分位數(shù)(Δ9-desaturase活性≤0.12)相比，第三(0.14%<Δ9-desaturase活性≤0.17)和最高四分位數(shù)(Δ9-desaturase活性>0.17)患DM的OR分別為：0.24(95%CI:0.08～0.70，Wald值=6.81，P<0.01)和0.15(95%CI:0.05～0.44，Wald值=11.82，P<0.01)，CE22∶6和Δ9-desaturase均表現(xiàn)出對(duì)DM的保護(hù)作用。進(jìn)一步校正 BMI、FPG、TC、TG后建立模型2進(jìn)行Logistic回歸分析及Wald檢驗(yàn)，趨勢(shì)更加顯著，并且與最低四分位數(shù)相比，CE22∶6的第三和最高四分位數(shù)以及Δ9-desaturase活性第二、第三和最高四分位數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Δ9-desaturase活性隨著四分位數(shù)增大患DM的OR值變小(表3)，由此可見CE22∶6含量或Δ9-desaturase活性高對(duì)2型DM可能具有保護(hù)作用。

表 2 DM組和對(duì)照組脂肪酸含量比較[M(Q1～Q3)]

DM：同表1；CE：膽固醇酯；SFA：飽和脂肪酸；MUFA：?jiǎn)尾伙柡椭舅?；PUFA：多不飽和脂肪酸；desaturase：脂肪酸脫氫酶；elongase：碳鏈延長(zhǎng)酶

表 3 CE22∶6和Δ9-desaturase水平與DM的相關(guān)關(guān)系

血清膽固醇酯脂肪酸含量與其他生化指標(biāo)相關(guān)性分析

由于樣本中脂肪酸呈非正態(tài)分布，因此采用Spearman偏相關(guān)分析血清膽固醇酯脂肪酸含量與其他生化指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果顯示，CE14∶0和CE20∶3與FPG呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.18，-0.17，P均<0.05)；飽和脂肪酸CE18∶0與BMI、TG、ApoB呈顯著正相關(guān)(r=0.25，0.24，0.17，P均<0.05)而與HDL-C、ApoAI呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.39，-0.35，P均<0.01)；CE20∶3與BMI的相關(guān)性最強(qiáng)(r=0.42，P<0.01)；Δ6- desaturase活性與BMI呈顯著正相關(guān)(r=0.29，P<0.01)，而Δ5- desaturase活性與BMI和TG均呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.33,-0.23，P均<0.01) (表4)。

討 論

本研究中，CE14∶0、CE16∶1和CE22∶6三種脂肪酸以及Δ9-desaturase活性在老年2型DM患者中顯著降低，進(jìn)一步Logistic回歸分析顯示，CE22∶6和Δ9-desaturase可能對(duì)預(yù)防2型DM的發(fā)生具有積極作用。CE14∶0和CE16∶1可在人體內(nèi)合成，不是人體必需脂肪酸，因此其含量多少不能真實(shí)反映攝入的水平，與DM的發(fā)生可能無(wú)直接關(guān)系，因此在進(jìn)行Logistic回歸分析后未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CE22∶6屬于Omega- 3脂肪酸中的一種，其在體內(nèi)不能合成，僅可從外源Omega- 3脂肪酸補(bǔ)充劑及深海魚類獲取，體內(nèi)含量可反映攝食脂肪酸性質(zhì)。大量的研究顯示Omega- 3脂肪酸可以保護(hù)DM心血管、降低2型DM的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[6- 8]，本研究中CE22∶6與2型DM的關(guān)系與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論一致。SFA、MUFA以及PUFA等未顯示出與2型DM有關(guān)。Van Woudenbergh等[3]指出Δ9-desaturase活性降低可能是SFA與2型DM呈正相關(guān)的機(jī)制。在本研究中，雖未觀察到總SFA有明顯變化，但是Δ9-desaturase活性顯著降低，為Van Woudenbergh提出的2型DM患者SFA向MUFA轉(zhuǎn)換可能降低提供了很好的證據(jù)，且本研究顯示，在校正年齡、性別、BMI、TC、TG、FPG因素之后，Δ9-desaturase活性的第二、第三、最高四分位數(shù)與最低四分位數(shù)相比，OR值分別為0.30(95%CI:0.09～0.95)、0.09(95%CI: 0.02～0.33)、0.06(95%CI: 0.01～0.22)。以上結(jié)果表明，老年2型DM患者具有較低的Δ9-desaturase活性，Δ9-desaturase活性可能是2型DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)因子。

此外，相關(guān)性分析顯示飽和脂肪酸CE18∶0與BMI、TG、ApoB等心血管危險(xiǎn)因素呈顯著正相關(guān)，而與心血管保護(hù)因素HDL-C、ApoAI呈顯著負(fù)相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道的飽和脂肪酸是心血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素相一致[9]。CE20∶3與BMI和TG呈顯著正相關(guān)，但是與FPG呈顯著負(fù)相關(guān)。CE20∶3屬于Omega- 6脂肪酸，研究顯示Omega- 6脂肪酸與心血管疾病關(guān)系不一致，多認(rèn)為其可降低胰島素抵抗，降低患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[10- 11]。

表 4 各脂肪酸與其他生化指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)

BMI、FPG、TC、HDL-C、LDL-C、TG、ApoAI、ApoB、hsCRP：同表1； CE、SFA、MUFA、PUFA、desaturase、elongase：同表2；*P<0.05,**P<0.01

綜上所述，老年2型DM患者血清中部分膽固醇酯脂肪酸顯著降低，CE22∶6和Δ9-desaturase可能對(duì)老年2型DM具有保護(hù)作用，血清脂肪酸種類與BMI相關(guān)，平衡各脂肪酸攝入對(duì)防治2型DM具有重要意義。

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Detection of Serum Cholesterol Ester Fatty Acids in the Elderly with Type 2 Diabetes Mellitus

YU Song-lin1, ZHOU Wei-yan2, YANG Rui-yue3, LI Hong-xia3, ZHANG Shun-li2, ZHANG Tian-jiao2,ZHAO Hai-jian2, ZHANG Chuan-bao2, WANG Shu3, CHEN Wen-xiang2, DONG Jun3

1Department of Clinical Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Beijing 100730, China2Department of Biochemistry, National Center for Clinical Laboratories, Ministry of Health, Beijing 100730, China3Key Laboratory of Geriatrics, Institute of Geriatrics, Ministry of Health, Beijing 100730, China

DONG Jun Tel: 010-85138520, E-mail:jun_dong@263.net

Objective To evaluate the alteration of cholesterol ester fatty acids and related serum biochemical

parameters in elderly patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM). Methods Totally 73 T2DM patients(T2DM group) and 72 healthy subjects(control group) (aged ≥60 years) who

health check-ups in Beijing Hospital from August to December in 2012 were recruited and blood samples were collected. Eleven main cholesterol ester fatty acids in serum were determined with liquid chromatography tandem mass spectrometry, and endogenous conversions by desaturases and elongases were estimated from product-to-precursor ratios. Fasting plasma glucose(FPG), total cholesterol(TC), triglyceride(TG), high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C), apolipoprotein(Apo) AI(ApoAI), ApoB, and high sensitivity C-reactive protein(hsCRP) were analyzed with an automatic biochemistry analyzer and the results were statistically analyzed. Results CE14∶0, CE16∶1 and CE22∶6 in T2DM group were significantly lower than those in the control group(P<0.05), while no significant difference existed between other fatty acid compositions. Δ9-desaturase activity was lower in T2DM group compared with that in control group(P=0.001). After adjusting for age, gender, body mass index(BMI), TC, TG, and FPG，Logistic analysis showed the quartiles of CE22∶6 and Δ9-desaturase activity were associated with risk of type 2 DM, and the odds ratios were 0.27(95%CI: 0.08-0.86, Wald: 4.93,P<0.05)and 0.06(95%CI: 0.01-0.22, Wald:17.39,P<0.01), respectively, for comparison of the top to bottom quartile. Both CE14∶0 and CE20∶3 negatively correlated with FPG(r=-0.18,-0.17,P<0.05); CE18∶0 positively correlated with BMI and TG(r= 0.25, 0.24,P<0.01) and negatively correlated with HDL-C and ApoAI(r=-0.39,-0.35,P<0.01); CE20∶3 positively correlated with BMI, with a correlation coefficient of 0.42(P<0.01). Conclusions Several cholesterol ester fatty acids decrease in elderly T2DM patients. CE22∶6 and Δ9-desaturase may protect against T2DM. An appropriately balanced intake of fatty acids is helpful for the prevention of T2DM in the elderly population.

fatty acids; type 2 diabetes mellitus; desaturase

國(guó)家自然科學(xué)基金(81171647和81201337)

董 軍 電話：010-85138520，E-mail：jun_dong@263.net

R446

A

1674-9081(2014)03-0264-06

10.3969/j.issn.1674-9081.2014.03.004

2014- 04- 30)