壽瑋齡，吳 衛(wèi)，范連凱，謝 田，崔 巍

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730

·論 著·

凝血因子、易栓癥篩查三項(xiàng)及血管性血友病因子抗原的臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)

壽瑋齡，吳 衛(wèi)，范連凱，謝 田，崔 巍

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730

目的 對(duì)血栓與止血特殊項(xiàng)目的臨床檢測(cè)進(jìn)行全面性能評(píng)價(jià)，以期為臨床提供可靠的檢測(cè)結(jié)果。方法 按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)EP5-A2、EP9-A2文件及《衛(wèi)生部臨床血液學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求WS/T 406-2012文件》標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室ACL TOP 700全自動(dòng)凝血分析儀測(cè)定凝血因子(FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ)、易栓癥篩查三項(xiàng)(蛋白S、蛋白C及抗凝血酶-Ⅲ)和血管性血友病因子抗原(von Willebrand factor antigen, vWF:Ag)共12個(gè)項(xiàng)目的準(zhǔn)確度、不精密度、攜帶污染率、線性、方法學(xué)比對(duì)及參考范圍進(jìn)行全面性能評(píng)估。結(jié)果 美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)提供的12個(gè)項(xiàng)目質(zhì)評(píng)物檢測(cè)結(jié)果與靶值相比，除蛋白C低值外偏差均小于15%。8個(gè)凝血因子批內(nèi)不精密度為1.7%～4.4%，均小于4.5%；批間不精密度為2.2%～7.5%，均不大于7.5%。易栓癥篩查三項(xiàng)的批內(nèi)不精密度為1.0%～7.0%；批間不精密度為1.5%～10.5%。vWF:Ag批內(nèi)不精密度為2.2%～3.1%，批間不精密度為2.1%～4.1%。12個(gè)項(xiàng)目攜帶污染率為0～2.63%，均小于3%。線性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蛋白S、蛋白C、抗凝血酶-Ⅲ及vWF:Ag相關(guān)系數(shù)為0.982～0.988，均≥0.975。ACL TOP 700與參比檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行比較，12個(gè)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)均≥0.975，一致性較好。廠商提供的參考范圍均適用于本實(shí)驗(yàn)室。結(jié)論 ACL TOP 700全自動(dòng)凝血分析儀對(duì)血栓與止血特殊項(xiàng)目檢測(cè)的準(zhǔn)確度、不精密度、攜帶污染率、現(xiàn)行線性范圍及參考范圍驗(yàn)證等性能評(píng)價(jià)良好，適用于臨床標(biāo)本檢測(cè)。

凝血分析儀；血栓與止血；性能

MedJPUMCH,2014,5(3):278-282

ACL TOP 700全自動(dòng)凝血分析儀是美國(guó)Instrument Laboratory公司生產(chǎn)的多參數(shù)凝血分析儀，可通過凝固法、發(fā)色底物法和免疫比濁法進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)EP5-A2和EP9-A2文件[1- 2]，以及《衛(wèi)生部臨床血液學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求WS/T 406- 2012文件》要求，全面驗(yàn)證即將投入使用的ACL TOP 700全自動(dòng)凝血分析儀性能，以評(píng)估該儀器對(duì)凝血因子(FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ)、血管性血友病因子抗原(von Willeband factor antigen，vWF:Ag)和易栓癥篩查三項(xiàng)：蛋白S(protein S, PS)、蛋白C(protein C, PC)、抗凝血酶-Ⅲ(anti-thrombin Ⅲ,AT-Ⅲ)等血栓與止血特殊項(xiàng)目的檢測(cè)是否可以用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)。

材料和方法

儀器與試劑

ACL TOP 700全自動(dòng)凝血分析儀及其配套試劑、定標(biāo)品與質(zhì)控品為美國(guó)Instrument Laboratory公司產(chǎn)品，STA-R全自動(dòng)凝血分析儀及其配套試劑與質(zhì)控品為法國(guó)Diagnostic Stago公司產(chǎn)品。

標(biāo)本

枸櫞酸鈉(109 mmol/L)抗凝新鮮靜脈血標(biāo)本，抗凝劑與標(biāo)本比例為1∶9，在1500×g下離心10 min，取上層血漿，在2 h內(nèi)完成檢測(cè)，或于-80 ℃分裝凍存，凍存標(biāo)本檢測(cè)前于37 ℃水浴15 min快速?gòu)?fù)溫。標(biāo)本無溶血、凝固、乳糜現(xiàn)象，紅細(xì)胞比容<55%。

測(cè)定方法

凝血因子及PS測(cè)定方法為凝固法，PC、AT-Ⅲ為發(fā)色底物法，vWF:Ag為免疫比濁法。

評(píng)估指標(biāo)

準(zhǔn)確度：采用美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)(College of American Pathologists, CAP)室間質(zhì)評(píng)物(CGE-A)進(jìn)行單次檢測(cè)，計(jì)算每份樣本檢測(cè)結(jié)果與靶值間的相對(duì)偏差。相對(duì)偏差(%)=(測(cè)定值-靶值)/靶值×100%。

攜帶污染率(carryover rate, CR)：取高值臨床樣本一份，連續(xù)測(cè)定3次；再取低值臨床樣本一份，連續(xù)測(cè)定3次。將測(cè)定結(jié)果記為H1、H2、H3和L1、L2、L3，按公式CR=|L1-L3|/(H3-L3)×100%計(jì)算。

線性驗(yàn)證：取高濃度混合血漿(H)、低濃度混合血漿(L)各一份，按5H、4H+L、3H+2L、2H+3L、H+4L、5L配成6個(gè)濃度梯度的混合血漿，按濃度從低到高各測(cè)定2次。其預(yù)期濃度按照公式：x=(CL×VL+CH×VH)/(VL+VH)計(jì)算。按照CLSI EP6-A文件提供的方案初步檢查數(shù)據(jù)，檢查離群值，判斷重復(fù)性，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析。之后進(jìn)行多元線性回歸，將結(jié)果分別擬合一次、二次、三次多項(xiàng)式，并進(jìn)行評(píng)價(jià)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：線性回歸方程的斜率在1±0.05范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r≥0.975。

比對(duì)：收集40例不同濃度血漿標(biāo)本，凝血因子與外院同型號(hào)儀器進(jìn)行比對(duì)，PS、PC、AT-Ⅲ及vWF:Ag分別在評(píng)估儀器和STAGO系統(tǒng)上進(jìn)行比對(duì)。參考CLSI EP9-A2文件提供的方案，分別以參比儀器測(cè)定結(jié)果為X，以評(píng)估系統(tǒng)測(cè)定結(jié)果為Y，繪制散點(diǎn)圖及偏倚圖，目測(cè)評(píng)價(jià)，顯示回歸方程Y=a+bX，同時(shí)評(píng)價(jià)不同檢測(cè)系統(tǒng)的平均百分偏差、相關(guān)系數(shù)(r)。

參考范圍驗(yàn)證：收集40例表觀健康人枸櫞酸鹽抗凝靜脈血，覆蓋各年齡段，男女比例各半。測(cè)定待驗(yàn)證項(xiàng)目，將檢測(cè)結(jié)果按照大小排序并計(jì)算極差R，然后分別計(jì)算最大值和最小值與其相鄰數(shù)值之差D；若D/R≥1/3，則將最大值或最小值視為離群值予以剔除；將余下數(shù)據(jù)重復(fù)前述步驟進(jìn)行離群值檢驗(yàn)，直至剔除所有離群值。同時(shí)應(yīng)另外選擇符合要求的個(gè)體以補(bǔ)足40例，確保檢測(cè)結(jié)果不含離群值。判斷標(biāo)準(zhǔn)：將40個(gè)驗(yàn)證數(shù)據(jù)與參考區(qū)間進(jìn)行比較，超出參考區(qū)間的數(shù)據(jù)≤4個(gè)(即超出參考區(qū)間的檢測(cè)數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)≤10%)時(shí)，驗(yàn)證通過。其中，vWF:Ag參考范圍按照O型與非O型血型分別進(jìn)行驗(yàn)證。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0軟件完成相關(guān)分析、回歸分析、重復(fù)測(cè)量方差分析及一致性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

準(zhǔn)確度

CAP質(zhì)評(píng)物檢測(cè)結(jié)果與靶值相比，除PC低值外，其余各項(xiàng)相對(duì)偏差均小于15%(表1)；12個(gè)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均在CAP回報(bào)給定允許范圍內(nèi)。

不精密度評(píng)價(jià)

8個(gè)凝血因子批內(nèi)不精密度及批間不精密度≤7.5%；易栓癥篩查三項(xiàng)批內(nèi)不精密度為1.0%～7.0%，批間不精密度為1.5%～10.5%；vWF:Ag批內(nèi)不精密度為2.2%～3.1%，批間不精密度為2.1%～4.1%(表2、3)。

攜帶污染率

凝血因子攜帶污染率為0.11%～2.63%，易栓癥篩查三項(xiàng)攜帶污染率為0～1.12%，vWF:Ag攜帶污染率為0.33%，均小于3%。

線性

PS、PC、AT-Ⅲ及vWF:Ag數(shù)據(jù)組中無明顯離群值，最佳擬合方程為一次多項(xiàng)式，回歸方程中b在0.99～1.03之間，a與0差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；相關(guān)系數(shù)在0.982～0.988之間，均≥0.975。其中AT-Ⅲ預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值見圖1。

表 1 凝血因子、易栓癥篩查三項(xiàng)和vWF:Ag準(zhǔn)確度結(jié)果

PS：蛋白S；PC：蛋白C；AT-Ⅲ：抗凝血酶-Ⅲ；vWF:Ag：血管性血友病因子抗原

表 2 凝血因子八項(xiàng)批內(nèi)不精密度及批間不精密度

CV：變異系數(shù)

表 3 易栓癥篩查三項(xiàng)及vWF:Ag批內(nèi)不精密度及批間不精密度

PS、PC、AT-Ⅲ、vWF:Ag：同表1；CV：同表2

方法學(xué)比對(duì)

凝血因子檢測(cè)在同系統(tǒng)間，易栓癥篩查三項(xiàng)、vWF:Ag檢測(cè)在不同系統(tǒng)間比較，r均≥0.975，不同儀器系統(tǒng)間一致性較好，平均百分偏差(%)除FⅤ(15.5%)及AT-Ⅲ(15.2%)外均小于15%(表4)。

圖 1 AT-Ⅲ線性驗(yàn)證

項(xiàng)目r偏差(%)凝血因子FⅡ0.993-8.5FⅤ0.98315.5FⅦ0.9983.7FⅧ0.9753.9FⅨ0.993-12.6FⅩ0.998-11.7FⅪ0.9897.7FⅫ0.9907.4易栓癥篩查三項(xiàng)PS0.9753.5PC0.9933.3AT-Ⅲ0.98315.2vWF:Ag0.9759.3

PS、PC、AT-Ⅲ、vWF:Ag：同表1

參考范圍驗(yàn)證

40例表觀健康人12個(gè)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均有大于等于90%在試劑說明書提供參考范圍內(nèi)。其中，20例O型表觀健康人vWF:Ag檢測(cè)結(jié)果為48.4%～202.3%，2例超出范圍(41.1%～125.9%)；20例A+B+AB型表觀健康人vWF:Ag檢測(cè)結(jié)果為57.7%～203.8%，2例超出范圍(61.3%～157.8%)。

討 論

凝血因子(FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ)活性和易栓癥篩查(PS、PC、AT-Ⅲ)項(xiàng)目是進(jìn)一步確診凝血系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng)相關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)，vWF:Ag是血管性血友病診斷的重要指標(biāo)；同時(shí)出凝血機(jī)制異常也與腫瘤等其他疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]，血栓與止血特殊項(xiàng)目檢測(cè)具有十分重要的臨床意義。良好的檢測(cè)系統(tǒng)是準(zhǔn)確結(jié)果的保證，國(guó)內(nèi)尚未見血栓與止血特殊項(xiàng)目性能驗(yàn)證的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)外文獻(xiàn)亦未見全面項(xiàng)目的相關(guān)報(bào)道。

本研究驗(yàn)證的12個(gè)項(xiàng)目的CAP質(zhì)評(píng)物檢測(cè)結(jié)果均在CAP回報(bào)范圍內(nèi)，除PC低值外，其余各項(xiàng)與靶值相比偏差均小于15%。在CAP回報(bào)結(jié)果中僅FⅧ、FⅨ和AT-Ⅲ三項(xiàng)進(jìn)行了檢測(cè)系統(tǒng)區(qū)分，其余各項(xiàng)為全球所有實(shí)驗(yàn)室回報(bào)結(jié)果計(jì)算均值，可能會(huì)使偏差大于同系統(tǒng)間的實(shí)際偏差。同時(shí)，《WS/T 406-2012文件》規(guī)定準(zhǔn)確度驗(yàn)證應(yīng)至少使用5份質(zhì)評(píng)物，但現(xiàn)有CAP質(zhì)評(píng)物僅2份，需進(jìn)一步完善評(píng)價(jià)結(jié)果。

本研究批內(nèi)與批間不精密度與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[4]，但PS批內(nèi)不精密度、批間不精密度高于其他項(xiàng)目，這與其試劑穩(wěn)定性有關(guān)。PS測(cè)定試劑的機(jī)上有效時(shí)間為1 h，乏PS血漿的機(jī)上有效時(shí)間為4 h，且試劑配制過程對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，提示在常規(guī)工作中需注意PS相關(guān)檢測(cè)試劑的配制及使用時(shí)間，減少因試劑原因?qū)е碌臋z測(cè)結(jié)果假性降低。必要時(shí)可在檢測(cè)過程中增加質(zhì)控頻次，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)明確本實(shí)驗(yàn)室所檢測(cè)的PS抗原為血漿中總PS還是游離PS。

ACL TOP 700與運(yùn)行良好的其他檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行比較，12個(gè)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r均≥0.975，一致性較好。文獻(xiàn)報(bào)道凝血功能分析的系統(tǒng)差異僅見于凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間、纖維蛋白原等初篩項(xiàng)目[5]，少有特殊項(xiàng)目的分析。不同檢測(cè)系統(tǒng)間APTT試劑激活劑種類的不同(鞣花酸、硅藻土)可影響FⅧ、FⅨ、FⅪ及FⅫ的檢測(cè)結(jié)果；檢測(cè)原理的不同如磁珠法還是光學(xué)法，散射光還是透射光，也會(huì)影響到檢測(cè)結(jié)果[6]。對(duì)于不同的檢測(cè)系統(tǒng)，提高對(duì)試劑性能和溯源性的要求，有利于減少系統(tǒng)間差異。

廠商試劑說明書提供的參考范圍均適用于本實(shí)驗(yàn)室。需注意的是vWF:Ag參考范圍應(yīng)按血型劃分[7]，不可籠統(tǒng)只取一個(gè)參考范圍，在臨床診斷血管性血友病過程中要充分考慮ABO血型系統(tǒng)對(duì)vWF:Ag的影響。

綜上，ACL TOP 700全自動(dòng)凝血分析儀血栓與止血特殊項(xiàng)目檢測(cè)攜帶污染率、現(xiàn)行線性范圍及參考范圍驗(yàn)證等性能評(píng)價(jià)良好，適合臨床標(biāo)本檢測(cè)。本研究性能驗(yàn)證數(shù)據(jù)與國(guó)外文獻(xiàn)基本一致，但目前血栓與止血特殊項(xiàng)目準(zhǔn)確度和不精密度性能驗(yàn)證及比對(duì)等要求國(guó)內(nèi)外均無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，還需相關(guān)組織進(jìn)一步完善和確認(rèn)上述項(xiàng)目的性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。

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[2]National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method comparison and bias estimation using patient samples; Approved guideline. EP9-A2 [S]. Wayne, PA: NCCLS, 2002.

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Performance Evaluation of Clinical Detection of Coagulation Factors, Protein S,Protein C, Anti-thrombin Ⅲ, and von Willebrand Factor Antigen

SHOU Wei-ling, WU Wei, FAN Lian-kai, XIE Tian, CUI Wei

Department of Clinical Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Beijing 100730, China

CUI Wei Tel: 010-69159713，E-mail：cuiw@pumch.cn

Objective To conduct a comprehensive performance evaluation of fully automated coagulation analyzer in testing coagulation factors, protein S(PS), protein C(PC), anti-thrombin Ⅲ (AT-Ⅲ), and von Willebrand factor antigen (vWF:Ag). Methods According to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP5-A2, EP9-A2, and WS/T 406-2012 specifications, coagulation factors(FⅡ, FⅤ, FⅦ, FⅧ, FⅨ, FⅩ, FⅪ, and FⅫ), PS, PC, AT-Ⅲ, and vWF:Ag were detected in the apparatus to evaluate the accuracy, within-run and between-run imprecisions, linear range, carryover rate, method comparisons, and reference range of the ACL TOP 700 coagulation analyzer. Results The instrument had high accuracy and precision, a good linear range, and low carryover rate (0-2.63%, <3%). The biases of the 12 College of American Pathologists (CAP) controls compared with the target value were all less than 15%, excepting the low value of PC. The within-run imprecisions of 8 coagulation factors were 1.7%-4.4%, and the between-run imprecisions were 2.2%-7.5%. The within-run imprecisions of 3 thrombophilia screen tests and vWF:Ag were 1.0%-7.0% and 2.2%-3.1%, and he between-run imprecisions were 1.5%-10.5% and 2.1%-4.1%, respectively. The carryover rates of the 12 items ranged from 0 to 2.63%. Results of liner verification test showed the correlation coefficients of PS, PC, AT-Ⅲ, and vWF:Ag were 0.982-0.988. Results of method comprisons showed the correlation coefficients of ACL TOP 700 and other coagulation analyzer were more than 0.975, and the recommended reference ranges of all the 12 items were appropriate for our laboratory. Conclusions ACL TOP 700 coagulation analyzer has a good performance in accuracy, imprecision, carryover rate, linear range, and method comparison. It is suitable for detection of clinical specimens.

coagulation analyzer; thrombosis and homeostasis; performance

崔 巍 電話：010-69159713，E-mail：cuiw@pumch.cn

R446.11

A

1674-9081(2014)03-0278-05

10.3969/j.issn.1674-9081.2014.03.007

2014- 05- 04)