李祖明，常 平，高麗萍，惠伯棣，白志輝

(1.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191;2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085)

輔酶Q10是一種脂溶性的類維生素物質(zhì)，廣泛存在于生物體細(xì)胞的線粒體上，主要結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上，構(gòu)成呼吸鏈中的重要遞氫體［1-2］。具有清除自由基、維持細(xì)胞膜的通透性和提高機(jī)體自身免疫力的功能，在臨床醫(yī)藥、營養(yǎng)保健品及化妝品等方面具有廣闊的應(yīng)用前景［3-7］。資料顯示，目前全球輔酶Q10年消費(fèi)量高達(dá)500多t，而我國年需求量約為60多t［3］。但由于輔酶Q10是微生物發(fā)酵所得的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，故其提取過程中首先需要進(jìn)行細(xì)胞破壁，因此細(xì)胞破碎是提取輔酶Q10的關(guān)鍵步驟之一，直接影響著輔酶Q10的生物活性、收率和成本［1，6］。燕瑋婷等［8］采用了4種機(jī)械破壁方法對稻曲病菌厚垣孢子進(jìn)行破碎，結(jié)果表明液氮研磨-超聲波處理破壁效果最好。楊新輝等［9］采用皂化法輔助超聲波優(yōu)化了三孢布拉霉菌番茄紅素的提取條件。超聲波作用于含酶溶液時，能產(chǎn)生空化、振蕩等作用，并可使酶分子構(gòu)象及催化部位微環(huán)境發(fā)生變化，深刻地影響催化活性;人們對超聲波影響酶催化過程新的深入認(rèn)識，將對酶化工領(lǐng)域產(chǎn)生積極的影響，其結(jié)果有可能創(chuàng)造一種安全、價廉和靠外力場強(qiáng)化酶催化過程的新方法，給酶法生產(chǎn)工業(yè)化帶來新的飛躍［10］。在天然生產(chǎn)輔酶Q10的微生物中，類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)被認(rèn)為是其潛在的良好生產(chǎn)菌［11-13］。類球紅細(xì)菌屬細(xì)菌域中紫色細(xì)菌群的α亞群，具廣泛代謝方式，可在多種生長條件下生長;大量研究文獻(xiàn)表明，類球紅細(xì)菌已成為一種非常有工業(yè)化開發(fā)潛力的微生物［14-15］。本研究采用酶法輔助超聲波法提取類球紅細(xì)菌輔酶Q10，通過單因素和正交實驗得到較優(yōu)提取條件，為深入研究和開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)3757菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCC NO.3757。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基(%):葡萄糖2.0，胰蛋白胨1.0，酵母粉1.0，NaCl 0.5，pH 7.2;固體培養(yǎng)基在種子培養(yǎng)基中添加2.0%瓊脂;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)［14］:乳酸鈉4.0，硫酸銨1.0，磷酸氫二鉀0.9，磷酸二氫鉀0.6，硫酸鎂0.2，無水氯化鈣0.075，硫酸亞鐵0.012，EDTA 0.02，微量元素溶10 mL，生長因子溶液10 mL，pH 7.2。其中，微量元素溶液配方(g/L):硼酸2.8，硫酸錳1.6，鉬酸鈉0.76，硫酸鋅0.24，硫酸銅0.04;生長因子溶液配方(g/L):維生素B1 1.0，煙酰胺(VPP)1.0，生物素0.016，對氨基苯甲酸1.0。

1.2 方法

1.2.1 菌體制備 將活化的類球紅細(xì)菌3757接種于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于32℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，得液體種子。按5%接種量將液體種子接種到盛有基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于32℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，6 000 r/min離心10 min，用蒸餾水洗滌菌體2次備用。

1.2.2 超聲波處理初始條件 用甲醇∶氯仿(1∶2)溶液按料液比1∶10將菌體制成菌懸液，超聲波振幅20%，輻射時間間歇時間1 min/1 min，超聲波總時間(包括輻射和間歇時間)6 min。超聲波破處理后靜置30 min，6 000 r/min離心20 min，上清液即為輔酶Q10提取液。

1.2.3 酶法輔助超聲波法初始條件 用pH 7.2的磷酸緩沖液按料液比1∶10將菌體制成菌懸液。將溶菌酶用蒸瘤水配成5 mg/mL的酶液，5 mL菌懸液中加入300 μL酶液，酶解溫度37℃，酶解時間2 h。酶處理后，6 000 r/min離心20 min，收集菌體;然后采用超聲波法較優(yōu)條件處理菌體。

1.2.4 輔酶Q10測定 采用紫外分光光度計測定輔酶Q10［1，16］。取輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇∶氯仿(1∶2)溶液配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于275 nm測定其吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后于275 nm測定樣品的吸光值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中輔酶Q10的提取率。樣品中輔酶Q10提取率計算公式:X=C×f×1 000/1 000;式中:X為樣品中輔酶Q10的提取率(mg/L);C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的輔酶Q10濃度(μg/mL);f為樣液稀釋倍數(shù)。

1.2.5 單因素實驗 在超聲波法初始條件下，先后改變超聲振幅、超聲波總時間(工作和間歇時間)、料液比、超聲工作/間隔時間進(jìn)行單因素實驗，分別考察其對輔酶Q10提取率的影響。在酶法輔助超聲波法初始條件下，先后改變酶添加量、pH、酶解溫度和酶解時間進(jìn)行單因素實驗，分別考察其對輔酶Q10提取率的影響。

1.2.6 正交實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，選擇合適的因素和水平，進(jìn)行正交實驗，找出最優(yōu)的因素和水平，得到較高的輔酶Q10提取率。

1.2.7 對比實驗 將優(yōu)化前超聲波法初始提取條件下輔酶Q10的提取率同酶法輔助超聲波法優(yōu)化后提取條件進(jìn)行比較，考察優(yōu)化提取條件前后輔酶Q10提取率的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 振幅對輔酶Q10提取率的影響

在超聲波法初始條件下，改變振幅分別為20%、30%、40%和50%，以最高提取率為100%，考察其對輔酶Q10提取率的影響，結(jié)果見圖1。可見，當(dāng)振幅為30%時，輔酶Q10提取率最高。

圖1 超聲波振幅對輔酶Q10相對提取率的影響Fig.1 Effect of vibration amplitude of ultrasonic treatment on relative extraction rate of coenzyme Q10

2.2 超聲波總時間對輔酶Q10提取率的影響

在超聲波法初始條件下，改變超聲波總時間分別為2、6、10、14和18 min，以最高提取率為100%，考察其對輔酶Q10提取率的影響，結(jié)果見圖2。隨超聲波總時間的增加，輔酶Q10提取率逐漸上升，當(dāng)超聲波總時間為10 min時，輔酶Q10提取率最高;其后提取率反而降低。這主要是由于破碎時間過長延長了輔酶Q10與氧氣、光的接觸時間，導(dǎo)致輔酶Q10降解。并且由于作用時間過長使細(xì)胞過于粉碎，導(dǎo)致大量蛋白和其他雜質(zhì)被提取出來，增加了后續(xù)提取分離的難度，影響產(chǎn)品的純度［6］。可見，較優(yōu)超聲波總時間為10 min。

圖2 超聲波總時間對輔酶Q10相對提取率的影響Fig.2 Effect of total time of ultrasonic treatment on relative extraction rate of coenzyme Q10

2.3 料液比對輔酶Q10提取率的影響

在超聲波法初始條件下，改變料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35，以最高提取率為100%，考察其對輔酶Q10提取率的影響，結(jié)果見圖3。隨提取劑用量的增大，細(xì)胞濃度降低，有利于細(xì)胞破碎，這是因為細(xì)胞濃度越高，液體的粘稠度越大，不利于空化泡的形成及其膨脹和爆炸，導(dǎo)致破碎效果較差。但超過最適料液比1∶20后，當(dāng)提取劑用量再繼續(xù)增大時，破損率降低;這可能是由于提取劑用量越大，超聲波在提取劑中傳遞的損失也就越大，破碎效果相應(yīng)也就越差［6］?？梢?，較優(yōu)料液比為1∶20。

圖3 料液比對輔酶Q10相對提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of material to liquid on relative extraction rate of coenzyme Q10

2.4 超聲波工作/間隔時間對輔酶Q10提取率的影響

超聲波法初始條件下，改變工作/間隔時間分別為3 min/1 min、2 min/1 min、1 min/1 min、1 min/2 min和 1 min/3 min，以最高提取率為100%，考察超聲波工作/間隔時間對輔酶Q10提取率的影響，結(jié)果見圖4。超聲波通過空化效應(yīng)破碎細(xì)胞的過程實際就是空化泡形成、振動、膨脹、壓縮和崩潰閉合的過程，該過程需要一段短暫的時間來完成，短時多次的工作方式能使超聲波產(chǎn)生的空化泡，有足夠的時間和更多機(jī)會完成膨脹和爆炸過程，因此有利于細(xì)胞的破碎［6］。可見，當(dāng)工作/間隔時間為1 min/1 min時，輔酶Q10提取率最高。

2.5 酶添加量對輔酶Q10提取率的影響

在酶法輔助超聲波法初始條件下，改變?nèi)芫柑砑恿糠謩e為100、300、500、700和900 μL，以最高提取率為100%，考察酶添加量對輔酶Q10提取率的影響，結(jié)果見圖5。當(dāng)溶菌酶添加量為300 μL時，輔酶Q10提取率最高，其后隨酶添加量的進(jìn)一步增加，輔酶Q10提取率呈下降趨勢?？梢姡^優(yōu)的酶添加量為300 μL。

圖4 超聲波工作/間隔時間對輔酶Q10相對提取率的影響Fig.4 Effect of work/rest time of ultrasonic treatment on relative extraction rate of coenzyme Q10

圖5 酶添加量對輔酶Q10相對提取率的影響Fig.5 Effect of amount of enzyme on relative extraction rate of coenzyme Q10

2.6 酶解pH對輔酶Q10提取率的影響

在酶法輔助超聲波法初始條件下，改變pH分別為6.2、6.7、7.2、7.7和8.2，以最高提取率為100%，考察pH對輔酶Q10提取率的影響，結(jié)果見圖6。當(dāng)pH為7.2時，輔酶Q10提取率最高?？梢?，最適酶解pH為7.2。

2.7 酶解溫度對輔酶Q10提取率的影響

在酶法輔助超聲波法初始條件下，改變酶解溫度分別為27、32、37、42和47℃，以最高提取率為100%，考察酶解溫度對輔酶Q10提取率的影響，結(jié)果見圖7。隨酶解溫度升高，輔酶Q10提取率逐漸提高，當(dāng)酶解溫度37℃時，輔酶Q10提取率最高，其后又下降。可見最適酶解溫度為37℃。

圖6 酶解pH對輔酶Q10相對提取率的影響Fig.6 Effect of pH of zymoIysis on relative extraction rate of coenzyme Q10

圖7 酶解溫度對輔酶Q10相對提取率的影響Fig.7 Effect of temperature of zymoIysis on relative extraction rate of coenzyme Q10

2.8 酶解時間對輔酶Q10提取率的影響

在酶法輔助超聲波法初始條件下，改變酶解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h，以最高提取率為100%，研究其對輔酶Q10提取率的影響，結(jié)果見圖8。隨酶解時間延長，輔酶Q10提取率逐漸增大，當(dāng)酶解時間為2 h時，輔酶Q10提取率最高?？梢?，較優(yōu)的酶解時間為2 h。

圖8 酶解時間對輔酶Q10相對提取率的影響Fig.8 Effect of time of zymoIysis on relative extraction rate of coenzyme Q10

2.9 正交實驗

單因素試驗時發(fā)現(xiàn)，超聲波總時間、料液比、溶菌酶添加量和酶解時間對輔酶Q10提取率的影響較顯著。超聲波振幅和超聲波工作/間隔時間對輔酶Q10提取率的影響不顯著。最適酶解pH為7.2，最適酶解溫度37℃。因此采用超聲波總時間、料液比、溶菌酶添加量和酶解時間進(jìn)行L9(34)正交試驗，因素水平見表1。實驗結(jié)果與分析見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交實驗結(jié)果與分析Table2 Results and analysis of orthogonal experiment

從表2可以看出，對輔酶Q10提取率影響因素主次順序為料液比＞超聲波總時間＞酶添加量＞酶解時間。結(jié)合單因素實驗結(jié)果，得到輔酶Q10較優(yōu)提取條件:超聲波總時間14 min，超聲波振幅30%，超聲波工作/間歇時間1 min/1 min，料液比1∶15，酶添加量300 μL，酶解pH 7.2，酶解溫度37℃，酶解時間90 min。

2.10 對比實驗

分別在優(yōu)化前超聲波法初始條件和酶法輔助超聲波法優(yōu)化后條件下從類球紅細(xì)菌中提取輔酶Q10。結(jié)果表明優(yōu)化前輔酶Q10提取率為51.9 mg/L，優(yōu)化后輔酶Q10提取率為99.6 mg/L。可見，優(yōu)化后的提取率比優(yōu)化前提高了91.9%。

3 結(jié)論

本研究采用單因素和正交實驗優(yōu)化了酶法輔助超聲波法提取類球紅細(xì)菌輔酶Q10的提取條件，正交實驗結(jié)果顯示各因素影響輔酶Q10提取率的順序為料液比＞超聲波總時間＞酶添加量＞酶解時間。綜合單因素和正交實驗結(jié)果，得到輔酶Q10較優(yōu)的提取條件:超聲波總時間14 min，超聲波振幅30%，超聲波工作/間歇時間1 min/1 min，料液比1∶15，酶添加量300 μL，酶解pH 7.2，酶解溫度37℃，酶解時間90 min。優(yōu)化前輔酶Q10提取率為51.9 mg/L，優(yōu)化后輔酶Q10提取率為99.6 mg/L。優(yōu)化后輔酶Q10提取率比優(yōu)化前提高了91.9%。這為類球紅細(xì)菌保健食品的研究開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］陶志杰，曹迪，王改玲，等.超聲波法輔助提取花生中輔酶Q10的工藝優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2012，33(18):53-56.

［2］朱俊豐，鄭方亮，艾海新，等.微波結(jié)合紫外誘變選育輔酶Q10高產(chǎn)菌株［J］.微生物學(xué)雜志，2010，30(2):57-62.

［3］王改玲，宋瑞雯，陶志杰，等.花生中輔酶Q10的提取工藝及含量測定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(5):236-239.

［4］田寶靜，李劍，聶立影，等.土壤桿菌中輔酶Q10的提取工藝［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2009，28(6):858-861.

［5］朱俊豐，季世坤，鄭方亮，等.輔酶Q10酸熱破碎法提取工藝條件的研究［J］.遼寧大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2010，37(1):67-70.

［6］李聚海，岳田利，袁亞宏.輔酶Q10超聲波破碎法提取工藝條件研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2007，35(5):207-211.

［7］Ha SJ，Kim SY，Seo JH，et al.Ca2+increases the specific coenzyme Q10 content inAgrobacterium tumefaciens［J］.Biopro-cess Biosyst Eng，2009，32(5):697-700.

［8］燕瑋婷，劉二明，鄧林偉，等.稻曲病菌厚垣孢子不同破壁方法的比較［J］.微生物學(xué)雜志，2010，30(2):14-17.

［9］楊新輝，孟憲軍，宋宇寧，等.三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的提取工藝及殘留溶劑去除［J］.微生物學(xué)雜志，2010，30(2):46-50.

［10］郭詩靜，黃卓烈，初志戰(zhàn)，等.超聲波對豬胰脂肪酶催化活性影響的機(jī)理研究［J］.生物技術(shù)通報，2007，(4):155-159.

［11］Yen HW，F(xiàn)eng CY，Kang JL.Cultivation ofRhodobacter sphaeroidesin the Stirred Bioreactor with Different Feeding Strategies for CoQ10［J］.Production.Appl Biochem Biotechnol，2010，160(5):1441-1449.

［12］Yen HW，Chiu CH.The influences of aerobic-dark and anaerobic-light cultivation on CoQ10 production byRhodobacter sphaeroidesin the submerged fermenter［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，41(5):600-604.

［13］Kien NB，Kong IS，Lee MG，et al.Coenzyme Q10 production in a 150-l reactor by a mutant strain ofRhodobacter sphaeroides［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2010，37(5):521-529.

［14］趙凱，于影，姜丹，等.1株類球紅細(xì)菌及其降解敵敵畏的特性［J］.環(huán)境科學(xué)，2009，30(4):1119-1204.

［15］Gu ZX，Chen DM，Han YB，et al.Optimization of carotenoids extraction fromRhodobacter sphaeroides［J］.LWT，2008，41(6):1082-1088.

［16］王根華，錢和，肖剛.發(fā)酵菌體中輔酶Q10的提取及其測定方法［J］.無錫輕工大學(xué)學(xué)報，2003，22(2):59-62.