張莊英，范文來，徐 巖

（教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，江南大學生物工程學院釀酒科學與酶技術研究中心，釀造微生物與應用酶學研究室，江蘇無錫 214122）

飲料酒中的氨基酸主要來源于釀酒原料中蛋白質的酶降解，發(fā)酵過程中微生物的代謝產物和發(fā)酵完畢后微生物細胞的自溶［1－4］。研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸對葡萄酒品質有重要影響［1］，是黃酒重要的營養(yǎng)成分和風味前驅體［5－6］，白酒中氨基酸可能對白酒的口味有影響［7］。飲料酒中的雜醇油主要來自于發(fā)酵過程中氨基酸的脫氨基和脫羰基代謝，如正丙醇來源于蘇氨酸、異丁醇來源于纈氨酸、異戊醇來源于亮氨酸，2－苯乙醇來源于苯丙氨酸等［4，8］。此外，在飲料酒的發(fā)酵過程中，氨基酸還與多種含氮化合物的形成相關。研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪類化合物是白酒的重要香氣成分［9－10］，吡嗪的雜環(huán)氮原子來自α－氨基酸［11］;白酒中氨基甲酸乙酯（EC，Ethyl Carbamate，一種2A類致癌物）和生物胺也與氨基酸含量有很大關系［12－13］。

國內外對飲料酒氨基酸對產品質量的影響已有較多研究［3，5，14－15］，但對我國白酒氨基酸的研究比較少。Fancisco等人［3］曾測定朗姆酒、威士忌和巴西甘蔗酒中的游離氨基酸，發(fā)現(xiàn)脯氨酸含量最高，代表性的氨基酸還有天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、酪氨酸和賴氨酸。朗姆酒和威士忌酒中 氨 基 酸 含 量 分 別 為 1.09 ～ 5.53mg/L、0.61 ～10.44mg/L，高于巴西甘蔗酒（0.68～5.59mg/L）。經(jīng)單因素方差分析，巴西甘蔗酒與朗姆酒中絲氨酸、丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸的含量有顯著差異，巴西甘蔗酒與威士忌中丙氨酸、精氨酸、酪氨酸和異亮氨酸的含量有顯著性差異;威士忌與朗姆酒中谷氨酰胺和脯氨酸的含量有顯著性差異。國內早期曾檢測過杜康酒的氨基酸，在杜康調味酒中檢測到蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、賴氨酸和組氨酸，成品酒中檢測到蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸。

鑒于氨基酸的重要性且國內外對白酒的氨基酸組成缺乏研究，本文旨在比較分析不同香型的白酒原酒和成品酒的游離氨基酸組成，進而為揭示白酒發(fā)酵、蒸餾和貯藏過程中含氮化合物的變化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬香型 郎酒原酒（52.3～57.2%vol）、成品酒（39.2～53.8%vol） 四川郎酒集團有限責任公司提供;習酒原酒（51.7%vol）、成品酒（53%vol） 貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司提供;濃香型 洋河大曲原酒（63.2～73.3%vol）、成品酒（55%vol） 江蘇洋河酒廠股份有限公司提供;習酒原酒（65.79%vol）、成品酒（52.9%vol） 貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司提供;清香型 汾酒原酒（44.0～46.0%vol）、成品酒（63～67%vol） 汾酒集團提供;寶豐酒原酒（78.2%vol）、成品酒（52%vol） 寶豐酒業(yè)有限公司提供;鳳香型 西鳳原酒（45.0～55.0%vol）、成品酒（45～65%vol） 陜西西風股份有限公司提供;兼香型 口子窖原酒（61.8～67.8%vol）、成品酒（52～55%vol） 安徽口子酒業(yè)股份有限公司提供;藥香型 董酒原酒（60～62%vol）、成品酒（46～54%vol） 貴州遵義董酒廠提供;豉香型 米香基酒（52.2%vol）成品酒粵宴酒 （45.0%vol）、鄉(xiāng)醇酒（28.0%vol）、九江雙蒸酒（29.5%vol）、九江雙蒸浸泡酒（53.0%vol） 廣東省九江酒廠有限公司提供;老白干香型 老白干原酒（58～66.5%vol） 河北衡水老白干釀酒（集團）有限公司提供;谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、瓜氨酸（Cit）、蘇氨酸（Thr）、甘氨酸（Gly）、精氨酸（Arg）、絲氨酸（Ser）、蛋氨酸（Met）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）、異亮氨酸（Ile）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、半胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、組氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）、鄰苯二甲醛（OPA，o－phthalaldehyde）、9－芴基甲氧基羰酰氯（FMOC，9－fluorenylmethylchloroformate）、三乙胺 美國西格瑪公司，色譜純;結晶乙酸鈉、醋酸、甲醇、乙腈、四氫呋喃 上海安譜科學儀器有限公司，色譜純;三氯乙酸（TCA，trichloroacetic acid） 國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

安捷倫液相色譜儀1100配有柱溫箱、自動進樣器、四元梯度泵和紫外檢測器 美國安捷倫公司;色譜柱 ODS HYPERSIL 250mm ×4.6mm ×5μm 美國默賽飛世爾科技;臺式離心機TGL－16G 上海安亭科技儀器廠;純水儀Millipore Simplicity UV 美國密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 準確吸取1mL酒樣于5mL離心管中，加入 1mL 10%TCA溶液，振蕩 1min。于10000r/min離心15min，經(jīng)0.45μm水相濾膜過濾后，取500μL于樣品瓶中，待進樣。

1.2.2 高效液相色譜定量方法 氨基酸的定性定量方法:以保留時間定性，采用峰面積外標法定量。色譜條件:分析方法為OPA FMOC柱前衍生化［16］，ODS HYPERSIL 色譜柱（250mm ×4.6mm ×5μm），柱溫為40℃，檢測波長為338nm，進樣量10μL。流動相A:稱取 8.0g結晶乙酸鈉于 1000mL燒杯中，加入1000mL水攪拌至所有結晶溶解，再加入225μL三乙胺，攪拌并滴加5%的醋酸，將 pH 調到7.20±0.05;加入5mL四氫呋喃，混合后用0.45μm的水相微孔濾膜過濾，備用。流動相B:稱取8.0g結晶乙酸鈉于1000mL燒杯中;加入400mL攪拌至所有結晶溶解;滴加2%醋酸將pH調到7.20±0.05;將此溶液加入到800mL乙腈和800mL甲醇混合液中，混合均勻后，用0.45μm的有機微孔濾膜過濾，備用。

氨基酸測定的洗脫程序見表1。

表1 氨基酸的高效液相色譜洗脫梯度Table 1 The elution gradient of high－performance liquid chromatography for amino acid

1.2.3 單因素方差分析 使用SPSS20軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結果與討論

2.1 不同香型原酒游離氨基酸的比較分析

2.1.1 不同香型原酒中游離氨基酸的定性定量 白酒原酒中 18 種游離氨基酸總量 12.19～131.14mg/L，其中91.49%的樣品中的游離氨基酸總量為12.19～29.41mg/L。不同香型原酒的游離氨基酸總量差異較大，濃香型原酒遠高于其他香型，鳳香型和老白干香型僅次于濃香型，豉香型含量最低;但同種香型不同白酒樣品的氨基酸總量差異不大（見表2）。

檢測到原酒中18種游離氨基酸是谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、精氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸。由表3可知，脂肪族氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、精氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸和賴氨酸）占游離氨基酸總量的 76.00%（老白干香型）～87.37（鳳香型），其中酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）含量最高，約占氨基酸總量的 28.73%（濃香型）～56.20%（藥香型）;其次是中性氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸），約占 3.85%（藥香型）～39.17%（濃香型）;羥基氨基酸（絲氨酸、蘇氨酸）約占氨基酸總量的10.12%（濃香型）～29.28%（豉香型）;另外，堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）約占 0.10%（豉香型）～7.12%（老白干香型）;含硫氨基酸（蛋氨酸、半胱氨酸）約占0.12%（豉香型）～1.70%（濃香型）。芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）約占 0.00%（豉香型）～6.8%（老白干香型）。雜環(huán)氨基酸（脯氨酸、組氨酸）約占0.00%（老白干香型）～4.99%（鳳香型）。由此可知，藥香型原酒酸性氨基酸含量最高，中性氨基酸含量最低;濃香型原酒中性和含硫氨基酸含量最高，酸性和羥基氨基酸含量最低;老白干香型原酒堿性和芳香族氨基酸含量最高，雜環(huán)氨基酸含量最低;豉香型原酒羥基氨基酸含量最高，堿性、含硫和芳香族氨基酸含量最低。

表2 不同香型原酒的游離氨基酸總量Table 2 The total free amino acid content in different aroma type Chinese base liquors

不同香型原酒游離氨基酸種類有差異（見表4）:醬香型和濃香型氨基酸種類最多（均檢測到17種），其次為兼香型（16種）和清香型（15種），豉香型氨基酸種類最少（12種）。在醬香和濃香型原酒中檢測到纈氨酸，但在其它6種香型中均未檢測到。

不同香型原酒同一種氨基酸含量差異不同:谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、精氨酸、纈氨酸、組氨酸和脯氨酸在不同香型原酒中含量差異不大，其中谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、蘇氨酸和甘氨酸含量均較高，占氨基酸總量的55.91%～95.54%;其它氨基酸在不同香型原酒中含量差異較大（見表4）。

2.1.2 不同香型原酒游離氨基酸的單因素方差分析基于不同香型原酒游離氨基酸種類和含量的差異，對8個香型的原酒進行單因素方差分析（見表4），結果表明:老白干香、醬香和濃香型原酒的氨基酸組成與其它香型差異顯著，其中老白干香型的谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和異亮氨酸與其它香型差異顯著，醬香型原酒的天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和纈氨酸與其它香型差異顯著，濃香型的天冬氨酸、蘇氨酸和絲氨酸與其它香型差異顯著;就氨基酸而言，不同香型原酒中的谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和甘氨酸差異顯著。

2.2 不同香型成品酒游離氨基酸的比較分析

2.2.1 不同香型成品酒中游離氨基酸的定性定量白酒成品酒游離氨基酸總量 13.66～34.01mg/L，高于威士忌（0.61～10.45mg/L）、朗姆酒（1.09～ 5.53mg/L）和巴西甘蔗酒（0.68～5.59mg/L）［3］，但較葡萄酒（500～1000mg/L）［17］和黃酒（3000～ 10000mg/L）［5］低。從表5可知不同香型原酒游離氨基酸總量有差異，濃香型氨基酸總量最高，清香型和豉香型僅次于濃香型，兼香型含量最低。

表5 不同香型成品酒的游離氨基酸總量Table 5 The total free amino acid content in different aroma type Chinese final liquors

白酒發(fā)酵時酒醅中的氨基酸可經(jīng)脫氨基和脫羧基代謝生成正丙醇、異丁醇、異戊醇和2－苯乙醇等雜醇油［11］，適宜的雜醇油含量及雜醇油之間的比例協(xié)調可使酒的口感柔和、協(xié)調，酒體豐滿圓潤，味道獨特，但含量過高則會影響酒的口感且對人體有害［18］。研究表明，藥香型成品酒中雜醇油含量較高（3852.26mg/L）［19］，其次是醬香型（1299.72mg/L）［20］、鳳香型（1233.91mg/L）［21］、老白干香型（1204.81mg/L）［21］、濃香型（1033.54mg/L）［22］、兼香型（568.23mg/L）［23］，清香型（505.35mg/L）［21］酒中雜醇油含量最低。分析表 5知雜醇油含量較低的清香型成品酒游離氨基酸總量較高，而雜醇油含量較高的藥香和醬香型酒中游離氨基酸總含量較低，由此可知白酒中的雜醇油含量與氨基酸含量呈現(xiàn)一定的負相關性。

表4 不同香型原酒游離氨基酸含量Table 4 The content of free amino acid in different aroma type Chinese base liquors

表6 白酒成品酒中不同種類的游離氨基酸占游離氨基酸總量的比例（%）Table 6 The distribution of different kinds of free amino acid in Chinese final liquors（%）

成品酒的18種游離氨基酸中脂肪族氨基酸含量最高（見表6），占游離氨基酸總量的83.66%（醬香型）～89.12（鳳香型），其中含量最高的是酸性氨基酸，約占氨基酸總量的 44.65%（濃香型）～57.87%（清香型）;其次是羥基氨基酸，占13.29%（醬香型）～28.84%（兼香型）;中性氨基酸占 10.06%（鳳香型）～18.90%（醬香型）;另外，含硫氨基酸占 0.06%（鳳香型）～4.26%（濃香型）;堿性氨基酸占 1.17%（清香型）～3.83%（老白干香型）。芳香族氨基酸含量較低，占游離氨基酸總量的0.00%（清香型、鳳香型、豉香型）～4.64%（濃香型）。雜環(huán)氨基酸含量最低僅占游離氨基酸總量的 0.00%（清香型）～2.16%（醬香型、藥香型）。由此分析知，醬香型成品酒中性、雜環(huán)氨基酸含量最高，羥基氨基酸含量最低;濃香型堿性、含硫和芳香族氨基酸含量最高，酸性氨基酸含量最低;清香型成品酒酸性氨基酸含量最高，堿性、雜環(huán)和芳香族氨基酸含量最低;而鳳香型中性、含硫和芳香族氨基酸含量最低。

不同香型的成品酒游離氨基酸種類有差異（見表7）:醬香型氨基酸種類最多（檢測到18種）;其次是濃香型成品酒（16種）;豉香型氨基酸種類最少（僅12種）。在醬香型成品酒中檢測到纈氨酸，其含量約占氨基酸總量的5.51%，而在其它香型白酒中未檢測到。

不同香型成品酒同一種氨基酸含量差異不同:谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、精氨酸和脯氨酸在不同香型白酒中含量差異不大，其中谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、蘇氨酸和甘氨酸含量均比較高，占氨基酸總量的 78.93%（濃香型）～94.55%（藥香型）;其它氨基酸在不同香型白酒中含量差異較大（見表7）。與威士忌游離氨基酸含量相比，白酒成品酒中的絲氨酸、組氨酸含量略低，丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸和賴氨酸基本保持在同等含量水平，其他氨基酸均高于威士忌;與朗姆酒相比，白酒成品酒的絲氨酸、組氨酸含量略低，丙氨酸、賴氨酸和脯氨酸含量基本保持在同等含量水平，而其它氨基酸含量均高于朗姆酒;與巴西甘蔗酒相比，白酒成品酒中絲氨酸、組氨酸和賴氨酸含量略低，脯氨酸含量基本持平，其它氨基酸含量均高于巴西甘蔗酒［3］。

2.2.2 不同香型成品酒氨基酸的單因素方差分析 對7個香型白酒成品酒的單因素方差分析結果進行統(tǒng)計（見表7），結果表明:醬香、濃香和兼香型成品酒的氨基酸組成與其它香型差異顯著，其中醬香型成品酒的天冬氨酸、瓜氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸與其它香型差異性顯著，濃香型的蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸與其它香型有顯著性差異，兼香型的蛋氨酸與其它香型差異性顯著;就氨基酸而言，不同香型成品酒的天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸含量有顯著差異。

表7 不同香型成品酒游離氨基酸含量Table 7 The content of free amino acid in different aroma type Chinese liquors

由于不同香型的白酒，釀酒原料、微生物種類、發(fā)酵條件、老熟過程和蒸餾過程各不相同，因而其氨基酸組成也有差異。

3 結論

對不同香型白酒原酒和成品酒的游離氨基酸進行比較分析，這是首次對白酒游離氨基酸進行系統(tǒng)研究。原酒游離氨基酸總量 12.19～131.14mg/L，濃香型氨基酸總量最高，豉香型最低;且醬香型和濃香型原酒的氨基酸種類最多，豉香型最少;經(jīng)過單因素方差分析，老白干香型、醬香型和濃香型原酒與其它香型的氨基酸組成差異性顯著，就氨基酸而言，谷氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和甘氨酸在不同香型原酒中有顯著差異。成品酒游離氨基酸總量 13.66～34.01mg/L，濃香型氨基酸總量最高，兼香型最低;且醬香型酒的氨基酸種類最多，豉香型最少;經(jīng)過單因素方差分析分析，醬香型、濃香型和兼香型成品酒與其它香型的氨基酸組成差異顯著，就氨基酸而言，天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸在不同香型成品酒中有顯著差異。

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