許春芳 許樂樂

吉西他濱是一種新型嘧啶類抗代謝藥，主要作用于DNA合成期和晚G1期，并可阻止細胞由G1期進入S期，是近30年來美國食品和藥物管理局(FDA)批準的第一個用于晚期胰腺癌治療的新藥。盡管吉西他濱單藥方案已經(jīng)成為胰腺癌輔助治療的標準方案，但其療效仍不能令臨床醫(yī)師滿意，且存在的不良反應也是阻止其更廣泛應用的主要原因，因此開發(fā)高效低毒的抗癌新藥和采用聯(lián)合化療方案仍是臨床努力的方向。本課題組前期研究[1]已證實淺藍菌素可以有效抑制胰腺癌細胞的生長并誘導細胞凋亡。為提高對化療藥物的敏感性，本研究進一步觀察淺藍菌素聯(lián)合吉西他濱是否對胰腺癌細胞的生長抑制具有協(xié)同作用，并探討其可能的機制。

材料和方法

一、實驗材料

BxPC3細胞株由第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院饋贈。淺藍菌素購于美國 Sigma 公司(批號 C2389)，-20℃保存，用<0.1%二甲基亞砜(DMSO)稀釋成50 mg/ml原液，再用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋成所需要的濃度。吉西他濱購于美國Sigma公司，實驗前用滅菌水稀釋成所需要的濃度。CCK-8購自日本同仁公司。AnnexinV-FITC細胞凋亡試劑盒購自Molecular Probes公司。Trizol購自Invitrogen公司。PCR所用試劑均購自TaKaRa公司。兔抗人Bcl-2、Bax抗體購自EPITMICE公司。鼠抗人β-actin單抗及羊抗兔和羊抗鼠二抗、細胞周期與凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術研究所。

二、實驗方法

1．CCK-8法：取對數(shù)生長期BxPC3細胞，混懸于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞密度為5×104/ml。取100 μl加入96孔板培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，分別加入含10 μg/ml淺藍菌素、20 μmol/L吉西他濱、10 μg/ml淺藍菌素+20 μmol/L吉西他濱(聯(lián)合)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞24、48、72 h，以加不含藥物培養(yǎng)液的細胞作為對照組。然后每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃孵育4 h。上酶聯(lián)免疫檢測儀檢測每孔450 nm波長的吸光度值(A450值)，以單純培養(yǎng)液的空白孔調(diào)零，計算細胞生長抑制率(IR)。IR=[1-(A450值對照組-A450值處理組)/A450值對照組]×100%。實驗重復3次，取均值。

2．AnnexinV/PI雙染法：BxPC3細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，棄培養(yǎng)液，分別加入上述3種含藥物的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，2 000 r/min離心5 min，PBS 洗滌2次，加入500 μl Binding Buffer、5 μl AnnexinV(FITC)，混勻后加入5 μl PI，混勻，室溫避光反應5～15 min，上流式細胞儀分析細胞凋亡。實驗重復3次。

3. RT-PCR法：將BxPC3細胞以1×105/ml 的密度接種于培養(yǎng)瓶，分別加入上述3種含藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，收集細胞。采用Trizol提取細胞總RNA。采用RT-PCR法檢測Bax、Bcl-2 mRNA表達。Bax引物上游5′-GCGTCCACCAAGAAGCTGA-3′，下游5′-ACCACCCTGGTCTTGGATCC-3′，產(chǎn)物312 bp；Bcl-2引物上游5′-CAGCTGCACCTGACGCCCTT-3′，下游5′-GCCTCCGTTATCCTGGATCC-3′，產(chǎn)物231 bp；內(nèi)參β-actin引物上游5′-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3′，下游5′-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3′，產(chǎn)物308 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再行PCR擴增。PCR參數(shù)：95℃ 5 min，95℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 38 s，30 個循環(huán)，最后72℃ 8 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外成像系統(tǒng)觀察，拍照，掃描。以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示mRNA相對表達量。

4．蛋白質(zhì)印跡法：收集各組培養(yǎng)細胞，提取總蛋白。測定蛋白濃度，取20 μg常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達。通過凝膠成像系統(tǒng)測定各條帶的灰度值，以目的條帶與β-actin的灰度值比表示蛋白相對表達量。實驗重復3次，取均值。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、各組BxPC3細胞增殖能力的變化

淺藍菌素組、吉西他濱組、聯(lián)合處理組BxPC3細胞的增殖抑制率均呈時間依賴性增加，且淺藍菌素聯(lián)合吉西他濱處理組具有明顯的協(xié)同效應(表1)。

二、各組BxPC3細胞凋亡的變化

對照組、淺藍菌素組、吉西他濱組、聯(lián)合處理組BxPC3細胞的早期凋亡率分別為(0.83±0.31)%、(31.37±1.04)%、(38.33±0.75)%、(69.43±0.83)%，各處理組均較對照組顯著增加，聯(lián)合處理組又較單藥處理組顯著增加，各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=3907.936，P<0.001，圖1)。

表1 淺藍菌素、吉西他濱及聯(lián)合用藥對BxPC3細胞增殖能力的影響(%，x±s)

橫坐標表示AnnexinFITC，縱坐標表示PI。左上象限：允許出現(xiàn)的檢測誤差；右上象限：死亡細胞和晚期凋亡細胞；左下象限：正常細胞；右下象限：早期凋亡細胞

圖1對照組(a)、淺藍菌素組(b)、吉西他濱組(c)、聯(lián)合處理組(d) BxPC3細胞凋亡圖

三、各組BxPC3細胞Bcl-2、Bax mRNA表達的變化

對照組、淺藍菌素組、吉西他濱組、聯(lián)合處理組BxPC3細胞的Bcl-2 mRNA表達量分別為0.67±0.01、0.44±0.01、0.36±0.08、0.27±0.07；Bax mRNA為0.14±0.01、0.31±0.02、0.32±0.03、0.91±0.06；Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值為4.78±0.13、1.39±0.04、1.15±0.02、0.30±0.02。各處理組細胞Bcl-2 mRNA表達較對照組下降，而Bax mRNA的表達較對照組升高，Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值較對照組下降，聯(lián)合治療組又較單藥處理組的變化更顯著，差異均有統(tǒng)計學意義(F值分別為4693.227、2770.298、1853.294，P值均為0.000，圖2)。

四、各組BxPC3細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的變化

對照組、淺藍菌素組、吉西他濱組、聯(lián)合處理組BxPC-3細胞的Bcl-2蛋白表達量分別為1.24±0.04、0.51±0.02、0.42±0.02、0.13±0.01；Bax蛋白表達量為0.20±0.05、0.47±0.01、0.54±0.01、1.21±0.03；Bcl-2/Bax比值為6.00±0.11、1.11±0.01、0.77±0.03、0.10±0.06。各處理組細胞Bcl-2表達均較對照組下降，而Bax表達較對照組升高，Bcl-2/Bax比值較對照組下降，聯(lián)合處理組又較單藥處理組的變化更顯著，差異均有統(tǒng)計學意義(F值分別為3530.252、2914.844、12133.729，P值均為0.000，圖3)。

圖2 對照組(1)、淺藍菌素組(2)、吉西他濱組(3)、聯(lián)合處理組(4)細胞Bcl-2、Bax mRNA的表達

圖3 對照組(1)、淺藍菌素組(2)、吉西他濱(3)、聯(lián)合處理組(4)BxPC3細胞Bcl-2、Bax蛋白的表達

討 論

胰腺癌是人類消化系統(tǒng)中惡性程度最高的腫瘤之一，5年生存率僅1%～4%，近年來在我國的發(fā)病率逐年上升。由于胰腺癌生長快速，早期診斷困難，因此70%～80%的患者確診時已屬晚期，失去手術機會，只能通過化療和其他非手術治療來緩解癥狀和延長生存期。目前使用的多數(shù)化療藥物效果不佳，中位生存期一般小于6個月[2]，同時不良反應較大。

吉西他濱是目前胰腺癌輔助治療中最為常用的化療藥之一，它是細胞周期特異性抗代謝類藥物，是一種嘧啶類似物，主要作用于晚G1期和S期的腫瘤細胞，可阻止癌細胞由G1期向S期的發(fā)展。它在細胞內(nèi)經(jīng)過核苷激酶的作用轉(zhuǎn)化成活性代謝物吉西他濱二磷酸酯或三磷酸酯，競爭性抑制DNA鏈的延長，最終導致細胞凋亡。它還可以通過抑制DNA連接而抑制腫瘤的生長，并掩蓋肽鏈的末端阻斷DNA修復。此外，它還能增強自我抗細胞毒素的能力，在改善晚期胰腺癌相關癥狀方面表現(xiàn)出顯著的療效。10年前的一項隨機對照研究比較了吉西他濱或5-氟尿嘧啶治療晚期胰腺癌患者的療效[3]，其中位生存期分別為5.7個月和4.2個月(P=0.00255)?；诖搜芯拷Y果，吉西他濱被美國FDA批準為晚期胰腺癌的一線化療藥物，為胰腺癌的治療帶來了新的希望。然而，吉西他濱對提高療效、 改善患者生活質(zhì)量有一定優(yōu)勢，但是患者生存期的延長及總生存率的升高并不顯著[4]，1年生存率為 18%，總生存時間為 10個月，中位生存時間約 6個月。由此可見，盡管吉西他濱單藥是胰腺癌輔助化療的標準方案，但其療效仍不能讓臨床醫(yī)師滿意。許多研究表明，聯(lián)合化療不但能夠提高抗腫瘤的效果，而且能減少抗腫瘤藥物的使用劑量，從而降低藥物的不良反應，提高患者化療耐受性。鑒于吉西他濱主要通過滲入DNA鏈誘導細胞凋亡，因此理論上可與其他能夠誘導癌細胞凋亡的抗腫瘤藥產(chǎn)生協(xié)同作用。在眾多驗證吉西他濱為基礎的聯(lián)合方案療效的Ⅲ期隨機對照臨床研究中，僅厄洛替尼聯(lián)合吉西他濱、貝伐單抗聯(lián)合厄洛替尼和吉西他濱2個方案可使患者得到有統(tǒng)計學意義的生存獲益，然而其中位生存期僅延長了0.33個月[5]及1.1個月[6]。因此，在晚期胰腺癌治療方面探索新的聯(lián)合治療模式以提高療效一直是研究的熱點。

淺藍菌素是藍色頭孢霉的自然代謝產(chǎn)物，能夠有效地抑制脂肪酸合酶的合成，抑制多種腫瘤細胞的生長、增殖，誘導腫瘤細胞的凋亡，抗瘤機制廣泛而復雜。實驗研究發(fā)現(xiàn)淺藍菌素在乳腺癌細胞株(包括雌激素依賴的乳腺癌細胞株MCF-7、ZR-75-1，非雌激素依賴的乳腺癌細胞株SKBR3、MDA435)及小鼠移植瘤模型實驗中抑制細胞生長，誘導細胞凋亡[7-8]。Lawrence等[9]用淺藍菌素作用于膀胱癌細胞株T2，發(fā)現(xiàn)淺藍菌素對其具有明顯的抑制作用。同樣，Okawa等[10]研究發(fā)現(xiàn)淺藍菌素具有抗多發(fā)性骨髓瘤的作用。盡管淺藍菌素抗腫瘤的作用可能因腫瘤類型和細胞株的不同而有所差異，但根據(jù)本課題組前期的實驗結果可見淺藍菌素對胰腺癌細胞株BxPC3的增殖生長有很強的抑制作用，并且能誘導BxPC3細胞凋亡，阻滯細胞于S期，并阻止細胞由S期進入G2期[11]，而吉西他濱主要阻止癌細胞由G1期向S期的發(fā)展，抑制DNA合成。因此設想淺藍菌素與吉西他濱聯(lián)合用藥對人胰腺癌細胞株BxPC3可能具有協(xié)同作用。

根據(jù)本課題前期實驗計算出淺藍菌素IC50為10 μg/ml，本研究選擇淺藍菌素為10 μg/ml與吉西他濱20 μmol/L聯(lián)合處理BxPC3細胞。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，單藥處理組和聯(lián)合用藥組腫瘤細胞的增殖活性均得到有效抑制，但聯(lián)合組表現(xiàn)出更加顯著的協(xié)同抑制效應，差異具有統(tǒng)計學意義。本研究結果還顯示淺藍菌素與吉西他濱均能促進BxPC3細胞的早期凋亡，但聯(lián)合組具有更明顯的促早期凋亡作用，且晚期凋亡率也明顯增加。

Bax、Bcl-2是線粒體途徑上游的凋亡調(diào)控基因，在細胞的凋亡中起著非常重要的作用。其中，Bcl-2是細胞凋亡抑制基因，Bax是細胞凋亡促進基因，Bax/Bcl-2的比值影響細胞凋亡的發(fā)生，是腫瘤發(fā)生的決定因素[12-13]。本研究結果顯示，淺藍菌素、吉西他濱處理胰腺癌BxPC3細胞48 h后，Bcl-2 mRNA及蛋白表達減少，Bax mRNA及蛋白表達增加，聯(lián)合作用組的效應更明顯。由此可見淺藍菌素與吉西他濱具有協(xié)同效應，其作用機制可能是二者聯(lián)合后使Bcl-2基因表達進一步下調(diào)，Bax基因表達進一步上調(diào)，從而使抑制胰腺癌BxPC3細胞增殖的作用明顯增強，并促進細胞凋亡。

參 考 文 獻

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