荊風(fēng)雪，朱衛(wèi)平，張學(xué)文

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128）

黃花蒿小孢子的發(fā)生和雄配子體的形成

荊風(fēng)雪，朱衛(wèi)平，張學(xué)文*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128）

黃花蒿是當(dāng)今優(yōu)良抗瘧藥青蒿素的藥源植物。采用石蠟切片法觀察了黃花蒿小孢子發(fā)生及雄配子體發(fā)育的細(xì)胞學(xué)過程。黃花蒿花藥為4室結(jié)構(gòu)；橫切面呈蝴蝶狀排列；花藥壁發(fā)育為典型單子葉型；花藥壁中層在花藥發(fā)育的較早期解體，其絨氈層由腺質(zhì)型絨氈細(xì)胞組成，在花粉成熟前絨氈層細(xì)胞原位解體；花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中，細(xì)胞分裂同步相差1～2個(gè)細(xì)胞周期，其細(xì)胞質(zhì)分裂則為同時(shí)型；經(jīng)2次分裂后形成的四分體為正四面體型；花藥開裂前的成熟花粉粒為2細(xì)胞型，含1個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和1個(gè)具2個(gè)細(xì)胞核的生殖細(xì)胞。

黃花蒿；小孢子；雄配子體

黃花蒿（Artemisia annua L.）為菊科蒿屬草本植物。20世紀(jì)70年代我國(guó)科技工作者首次從黃花蒿中分離出抗瘧特效藥青蒿素。青蒿素類抗瘧藥具有起效快、療效好、毒性低的特點(diǎn)，特別是對(duì)腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾療效更為突出，已成為瘧疾治療的主要藥物［1，2］。青蒿素類藥物對(duì)血吸蟲病、血絲蟲病、無(wú)名高燒等也有很好的療效。此外，還有研究［3］表明，青蒿素對(duì)癌癥、心律失常等也有潛在的應(yīng)用效果。目前黃花蒿仍為青蒿素的惟一藥源［4］，隨著青蒿素需求量增加，通過人工雜交培育高產(chǎn)量、高含量青蒿素黃花蒿品種具有十分重要的意義。為此我們開展了黃花蒿小孢子發(fā)生和花粉發(fā)育的觀察，以期為黃花蒿的種子繁殖、雜交育種提供生殖生物學(xué)方面的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃花蒿（Artemisiae annuae L.）為作者選育的高青蒿素含量黃花蒿新品種“黃花蒿428-A”。2011年3月上旬播種于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地，5月上旬移栽，移栽密度為50 cm×100 cm。8月中旬現(xiàn)蕾開始，選取不同發(fā)育時(shí)期的花序用FAA（70%乙醇、冰醋酸、甲醛混合液）固定，直到9月下旬開花結(jié)束。材料保存于FAA中。

1.2 方法

采集的花序用測(cè)微尺測(cè)定花序的直徑，根據(jù)花序直徑大小分組固定。

選取各組花序10個(gè)，用愛氏蘇木精進(jìn)行整體染色5 d，逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片（厚度10μm），展片，脫蠟，透明，中性樹膠封片。封片后在Olympus-BX51顯微鏡下觀察，用Olympus顯微攝影系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 花序直徑與花藥發(fā)育時(shí)期的相關(guān)性

黃花蒿的花為管狀花，形成頭狀花序（圖1-1），1個(gè)花序中包含10～20朵左右的小花?；ㄐ蛑睆脚c其雄蕊的發(fā)育具有一定的相關(guān)性?；ㄐ蛑睆脚c花藥發(fā)育時(shí)期對(duì)應(yīng)關(guān)系如表1。

黃花蒿小花直徑小于1.28 mm是花粉母細(xì)胞發(fā)育和減數(shù)分裂時(shí)期；小花直徑為1.28～1.45 mm時(shí)，為單核花粉發(fā)育期，此后是花粉成熟期。

2.2 花藥壁的發(fā)育

黃花蒿花藥有4室，橫切面呈蝴蝶狀（圖1-2）。早期花藥的細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)濃，主要由分生組織細(xì)胞構(gòu)成。隨著花藥的不斷發(fā)育，以后在花藥4個(gè)角隅處的表皮下分化出1列細(xì)胞，比周圍細(xì)胞體積大，細(xì)胞質(zhì)濃，分化為孢原細(xì)胞（圖1-3）。孢原細(xì)胞平周分裂1次形成2層細(xì)胞，外層為初生周緣細(xì)胞，內(nèi)層為初生造孢細(xì)胞（圖1-4）。初生周緣細(xì)胞平周分裂1次形成2層次生周緣細(xì)胞（圖1-5）。2層次生周緣細(xì)胞再平周分裂1次形成4層細(xì)胞，之后最外的1層分化為藥室內(nèi)壁，最內(nèi)的1層分化為絨氈層，中間2層分化為中層（圖1-6）。發(fā)育完整的藥室壁由5層細(xì)胞構(gòu)成，由外到內(nèi)分別為：表皮、藥室內(nèi)壁、中層（2層）和絨氈層（圖1-6）。據(jù)此推斷，黃花蒿的花藥壁發(fā)育類型為單子葉型［13］?；ㄋ幈诟鲗永^續(xù)發(fā)育，藥室內(nèi)壁細(xì)胞繼續(xù)增大，細(xì)胞壁纖維化轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維層。中層逐漸變得扁平（圖1-7～8），在花粉母細(xì)胞二分體時(shí)期開始解體（圖1-9）。初期絨氈層細(xì)胞與其他藥壁細(xì)胞無(wú)明顯差別（圖1 -6），吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后迅速增大，在次生造孢時(shí)期體積達(dá)到最大，細(xì)胞質(zhì)濃厚（圖1-7）。在花粉母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂后絨氈層細(xì)胞開始解體，細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)逐漸被花粉母細(xì)胞發(fā)育成雄配子體過程中所利用，到成熟花粉粒形成時(shí)，絨氈層細(xì)胞儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)被消耗殆盡（圖1-9～10）。絨氈層細(xì)胞在原位解體，細(xì)胞質(zhì)不流入到藥室內(nèi)，屬腺質(zhì)型絨氈層［13］。

2.3 小孢子產(chǎn)生和雄配子體形成

圖1 黃花蒿小孢子發(fā)育過程

在初生周緣細(xì)胞發(fā)育成花藥壁時(shí)，初生造孢細(xì)胞分裂產(chǎn)生大量次生造孢細(xì)胞（圖1-4）。次生造孢細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)迅速增大，逐漸發(fā)育成花粉母細(xì)胞（圖1-6～8）?；ǚ勰讣?xì)胞體積較大，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)濃厚，液泡不明顯，隨后進(jìn)入減數(shù)分裂（圖1-7～8）。經(jīng)減數(shù)分裂第1次核分裂形成二分體（圖1-9）。減數(shù)第1次核分裂后，其細(xì)胞質(zhì)不分裂（圖1-9）。接著進(jìn)入減數(shù)第2次分裂，第2次核分裂后進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)分裂形成4個(gè)小孢子，即為四分體（圖1-11）。細(xì)胞質(zhì)的分裂屬于同時(shí)型，4個(gè)小孢子被包裹在共同的胼胝質(zhì)中，呈正四面體排列（圖1-1）。胼胝質(zhì)溶解，釋放出4個(gè)小孢子，即單核花粉粒（圖1-12）。單核花粉粒細(xì)胞壁薄，細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央。隨后單核花粉粒的細(xì)胞壁收縮，體型變得不規(guī)則（圖1-12）。經(jīng)過收縮期后，單核花粉粒變成球形，此時(shí)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)小液泡，細(xì)胞核仍位于細(xì)胞中央（圖1-10）。隨后單核花粉粒小液泡融合成大的液泡，最后形成中央大液泡，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核移向細(xì)胞邊緣進(jìn)入單核靠邊期（圖1-13）。進(jìn)入單核靠邊期后，單核花粉粒細(xì)胞核進(jìn)行1次有絲分裂，形成營(yíng)養(yǎng)核和生殖核，生殖核緊貼細(xì)胞壁（圖1-14），之后再進(jìn)行1次不均等的細(xì)胞質(zhì)分裂，形成體積小、呈透鏡狀的生殖細(xì)胞和體積較大的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，形成尚未成熟的2細(xì)胞花粉（圖1-14）。生殖細(xì)胞開始緊貼花粉粒壁，以后逐漸向營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中漂移，懸浮在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖1-15）。到花藥裂開，花粉散出，形成成熟的2細(xì)胞花粉。傳粉后，生殖細(xì)胞在花粉管內(nèi)再分裂1次，產(chǎn)生2個(gè)精細(xì)胞，形成3細(xì)胞花粉粒，即雄配子體。

3 討論

1966年Davis［5］對(duì)菊科胚胎學(xué)特征進(jìn)行了描述，認(rèn)為花藥壁的發(fā)育類型為雙子葉型，絨氈層為變形絨氈層。后續(xù)對(duì)菊科植物藥壁發(fā)育觀察結(jié)果顯示，多數(shù)菊科植物的藥壁發(fā)育都是雙子葉型［6～9］，但在某些菊科植物中發(fā)現(xiàn)了其他發(fā)育類型。例如胡鐵鋒［10］發(fā)現(xiàn)，牛膝菊花藥壁發(fā)育過程中，2層次生周緣細(xì)胞不再進(jìn)行平周分裂，外層直接發(fā)育成藥室內(nèi)壁，內(nèi)層直接發(fā)育成絨氈層，發(fā)育完整的花藥壁沒有中層。筆者發(fā)現(xiàn)黃花蒿的花藥壁具2層中層細(xì)胞，其發(fā)育類型屬單子葉型，這些均有別于菊科植物普遍的雙子葉型發(fā)育。就絨氈層類型來說，黃衡宇等［6］對(duì)小蓬草，劉建全等［11］對(duì)款冬的胚胎學(xué)研究認(rèn)為，小蓬草和款冬的絨氈層類型為腺質(zhì)絨氈層。筆者發(fā)現(xiàn)黃花蒿的絨氈層類型也為腺質(zhì)絨氈層，均有別于菊科植物普遍的變形絨氈層。因此不同的菊科植物藥壁發(fā)育類型和絨氈層類型存在差異。Pullaiah［12］指出，絨氈層類型是菊科具有重要系統(tǒng)學(xué)意義的胚胎學(xué)性狀之一，藥壁發(fā)育類型和絨氈層類型與菊科植物系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系有待對(duì)更多的菊科植物藥壁發(fā)育進(jìn)行研究。

多數(shù)菊科植物藥壁的中層只有1層，而黃花蒿具有2層，與多數(shù)菊科植物的藥壁發(fā)育類型不一致。本研究發(fā)現(xiàn)在花藥發(fā)育過程中，中層和絨氈層先后解體，其營(yíng)養(yǎng)成分被花粉母細(xì)胞發(fā)育成雄配子體的過程中所利用。中層細(xì)胞一般含有淀粉等營(yíng)養(yǎng)成分［13］，中層細(xì)胞解體的時(shí)期比絨氈層要早，由此推測(cè)中層細(xì)胞解體過程中，將貯藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供給了絨氈層。而胡鐵鋒［10］研究牛膝菊花藥結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，牛膝菊花藥壁沒有中層，并且認(rèn)為缺少中層節(jié)省了在中層發(fā)育上所需的養(yǎng)分，將有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)盡可能多地提供給花粉粒的發(fā)育。目前有關(guān)菊科植物花藥壁中層何時(shí)解體的研究不多。鄭書馨等［7］認(rèn)為黃頂菊花藥壁的中層從花粉母細(xì)胞到四分體時(shí)期解體消失。本研究表明，黃花蒿花藥壁的中層在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期二分體時(shí)期解體。關(guān)于花藥壁中層的發(fā)育和解體與絨氈層發(fā)育的關(guān)系研究得比較少，如果中層細(xì)胞解體，將貯藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供給了絨氈層，那么中層的發(fā)育與解體可能影響到絨氈層的發(fā)育，進(jìn)而影響到花粉發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)供給，最終影響到花粉的育性，有關(guān)這方面的研究有待進(jìn)一步加強(qiáng)。Davis［5］認(rèn)為菊科植物的成熟花粉粒多為3細(xì)胞花粉粒。但胡鐵鋒［10］對(duì)牛膝菊和鄭書馨等［7］對(duì)黃頂菊的胚胎學(xué)研究發(fā)現(xiàn)牛膝菊和黃頂菊的成熟花粉粒均為2細(xì)胞花粉粒。筆者發(fā)現(xiàn)黃花蒿的成熟花粉粒也為2細(xì)胞花粉粒，與胡鐵鋒和鄭書馨等的研究結(jié)果一致。不同菊科植物的成熟花粉粒的類型存在差異。

［1］ 朱衛(wèi)平，劉仲華，盛孝邦.黃花蒿腺毛狀分泌腺的起源和發(fā)育［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，33（4）：416-418.

［2］ 屠呦呦，葉和春，楊 嵐，等.青蒿及青蒿素類藥物［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.

［3］ 譚 濤，秦宗會(huì)，譚 蓉.青蒿素類藥物的藥理作用［J］.中國(guó)藥業(yè)，2009，18（3）：63-64.

［4］ 朱衛(wèi)平，盛孝邦.青蒿素組織化學(xué)定位和含量相關(guān)性研究［J］.中草藥，2003，34（9）：852-854.

［5］ Davis GL.Systematic Embryology of the Angiosperm［M］.New York：John Wiley and Sons Inc.，1966：89-93.

［6］ 黃衡宇，龍 華，李 鸝.小蓬草的胚胎學(xué)研究［J］.武漢植物學(xué)研究，2009，27（3）：233～241.

［7］ 鄭書馨，任艷萍，王永周，等.黃頂菊小孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)育的研究［J］.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2009，17（4）：321-327.

［8］ 馬 虹，王迎春，曹 瑞，等.革苞菊胚胎學(xué)研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2000，20（3）：461-466.

［9］ 趙 崢，邱崇力，王定康，等.燈盞花大小孢子形成與胚胎發(fā)育［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2009，29（10）：1995-1999.

［10］胡鐵鋒.牛膝菊大、小孢子發(fā)生和雌、雄配子體的發(fā)育［J］.河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，26（2）：31-36.

［11］劉建全.款冬的胚胎學(xué)［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2001，21（3）：520-525.

［12］Pullaiah T.Embryology of Compositae［M］.New Delht：Today’s and Tomorrow’s Printers and Publishers，1984：51-53.

［13］胡適宜.被子植物生殖生物學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2005.

Microsporogenesis and Male Gametophyte Development of Artem isia annua L.

JING Feng-xue，ZHU Wei-ping，ZHANG Xue-wen*
（College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agriculutural University，Changsha，Hunan 410128，China）

Artemisia annua L.is onlymedicine source plant of artemisinin，a very effective antimalarialmedicine.In this paper the conventional paraffin section was adopted to observation of themicrosporogensis and themale gametophyte development of A.annua.The results are as follow：The anther has4 chambers and organizes in a butterfly shape in its transection.The development of anther wall belongs to themonocotyledonous type.The twomiddle layers of anther wall change from thickness into thinness in the earlier stage of the anther development and disintegrate in the dyads stage of the pollen mother cell（PMC）.The tapetum，of which each cell always disintegrates in the original position，is the secretory type. The cytokinesis aftermeiotic division of PMC is simultaneous type，and themicrospore arrangement in the tetrad is tetrahedra1.Themature pollen grains，which contain 1 vegetative cell and 1 reproductive cell，belong to a 2-cell type.

Artemsisia annua；Microspore；Male gametophyte

S567.9；Q944.4

：A

1001-5280（2014）02-0186-04

10.3969／j.issn.1001-5280.2014.02.18

2013 12- 05

荊風(fēng)雪（1985-），女，山東聊城人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué)，Email：jingxue2222＠126.com。*通信作者：張學(xué)文，教授，Email：xwzhang＠hunau.edu.cn。

湖南省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（2013CK4015）。