范東偉 陳仲強 侯曉飛

(北京大學第三醫(yī)院骨科，北京 100191)

·實驗研究·

柚皮苷硬膜外腔注射對髓核致坐骨神經(jīng)痛大鼠的疼痛行為影響*

范東偉 陳仲強**侯曉飛

(北京大學第三醫(yī)院骨科，北京 100191)

目的研究柚皮苷硬膜外腔注射對致坐骨神經(jīng)痛大鼠的疼痛行為學的影響。方法選擇雄性SD大鼠28只，制作髓核致坐骨神經(jīng)痛大鼠模型。隨機分為4組，每組7只大鼠。術后第3天開始注藥治療，柚皮苷組每日硬膜外腔注入柚皮苷注射液50 μl，地塞米松組每日硬膜外腔注入地塞米松注射液50 μl，生理鹽水組每日硬膜外腔注入生理鹽水50 μl，未注藥組硬膜外腔無藥物注入處理。檢測大鼠術前，術后及給藥后1、3、7、14 d的疼痛行為指標(50%機械性刺激縮足閾值和熱刺激縮足反應潛伏期)。結果4組大鼠在術后均對機械刺激產(chǎn)生明顯的痛覺過敏，與術前比較差異有顯著性(P<0.05)；柚皮苷組與地塞米松組在提高疼痛行為學指標的作用方面差異無顯著性(P>0.05)。結論硬膜外腔注射柚皮苷可有效改善髓核致坐骨神經(jīng)痛大鼠的疼痛反應。

柚皮苷； 坐骨神經(jīng)痛； 硬膜外注射

微創(chuàng)治療椎間盤突出引起的坐骨神經(jīng)痛和下腰痛是臨床外科研究的熱點[1]。硬膜外腔注射糖皮質(zhì)激素可以緩解神經(jīng)根水腫和炎癥，但臨床有效率差異較大，且長期反復應用可導致明顯副作用?，F(xiàn)代藥理學研究證實，我國傳統(tǒng)醫(yī)藥柚皮苷(naringin)具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用[2]。故本研究采用髓核致坐骨神經(jīng)痛的動物模型，對比硬膜外腔注射柚皮苷、地塞米松對坐骨神經(jīng)痛大鼠行為的影響[3]，為尋找微創(chuàng)治療腰椎間盤突出癥激素替代藥品提供臨床指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠32只，體重250～280 g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供[許可證號SYXK(京)2011-0039]。其中28只隨機分為4組，柚皮苷組(A組)、地塞米松組(B組)、生理鹽水組(C組)和未注藥組(D組)，每組7只。另外4只用來提供異體髓核。整個實驗過程嚴格按照國際疼痛學會《關于應用清醒動物進行疼痛實驗研究綱要》[4]要求來實施和完成。

1.2 動物模型制作

大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，在無菌條件下，做背正中切口，依次切開皮膚、皮下組織，暴露L5/S1棘突，從左側棘突上鈍性分離兩旁骶脊肌，暴露橫突，切除L5棘突、關節(jié)突關節(jié)和椎板，暴露L5背根神經(jīng)節(jié)。4組均在L5背根神經(jīng)節(jié)上植入尾椎髓核(1～2 mg)，硬膜外腔置入硬膜外腔導管，注意不造成機械壓迫。將硬膜外導管固定于棘間韌帶和皮下，逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚，術后3 d每日腹腔內(nèi)注射40萬U青霉素1次，以預防切口感染。

1.3 干預措施

術后觀察3天，第4天開始硬膜外腔注藥每日1次，柚皮苷組每日注入柚皮苷(100 μg)50 μl，地塞米松組每日注入地塞米松注射液(30 μg)50 μl，生理鹽水組每日注入生理鹽水50 μl，未注藥組不做處理。

1.4 行為觀察指標

手術前，治療前，治療后1、3、7、14天測量以下指標。

1.4.1 50%機械性刺激縮足閾值(50% paw withdrawal mechanical threshold，50%PWMT) 術前3 d每天分別測量大鼠雙側后足底機械刺激疼痛閾值，以得到其基礎痛閾。術后6周內(nèi)根據(jù)實驗需要采用Von Frey纖維在不同時間點測量大鼠雙側后足底機械痛閾。將1個20 cm×20 cm×25 cm的透明有機玻璃箱放置于頂部為鐵絲網(wǎng)的30 cm高的架子上，將待測大鼠置于箱中。Von Frey纖維通過鐵絲網(wǎng)格分別刺激大鼠雙側后足底中心部位，刺激強度由小到大，每個強度反復刺激5次(每次間隔15 s)，將誘發(fā)3次縮足反射以上的最小纖維強度定為大鼠的機械刺激回縮閾值。分別檢測各組大鼠雙后肢足底對Von Frey觸針誘發(fā)的回縮閾值。

1.4.2 熱刺激縮足反應潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL) 根據(jù)Hargreaves等[5]所描述的方法檢測：將大鼠置于底部為3 mm厚玻璃板的透明有機玻璃箱內(nèi)，用熱輻射刺激檢測。初次使用時調(diào)節(jié)光強度使術前大鼠基礎縮腿閾值在16 s左右。光透過玻璃板照射于大鼠后足，當出現(xiàn)下肢的特征性甩動、提足或舔舐時，手動切斷光源，記錄時間。每只大鼠測試3次，結果用手術側PTWL表示，兩次刺激間至少間隔5 min。預先設定輻射光源最長自動切斷時間為25 s，避免長時間照射造成大鼠灼傷。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 機械性刺激縮足閾值的變化

方差分析結果表明，處理主效應(不同的藥物組)(F=877.802，P=0.000)，時間主效應(F=755.261，P=0.000)，處理效應與時間效應的交互作用(F=72.045，P=0.000)均有統(tǒng)計學意義，說明時間因素的作用隨分組的不同而不同。

各組組間效應兩兩比較結果：與手術前相比，治療前大鼠后足底出現(xiàn)明顯機械刺激疼痛闊值降低，即出現(xiàn)機械刺激痛覺過敏。治療后第1、3、7和14天，柚皮苷組、地塞米松組、生理鹽水組的大鼠后肢足底50%PWMT與治療前相比顯著增加(P<0.05)，和未注藥組在上述時間點相比顯著增加(P<0.05)，其中柚皮苷組和地塞米松組在治療后7、14天時，在提高PWTL閾值效果上無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；未注藥組在上述時間段自身相比無顯著性變化(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 4組大鼠機械刺激右后肢足底回縮閾值(50%PWMT)變化

*未用藥組相同時間段與其他組兩兩比較P<0.05

#柚皮苷組、地塞米松組、生理鹽水組治療后與治療前比較P<0.05

2.2 熱刺激縮足反應潛伏期的變化

方差分析結果表明，處理主效應(不同的藥物組)(F=428.582，P=0.000)，時間主效應(F=72.886，P=0.000)，處理效應與時間效應的交互作用(F=126.501，P=0.000)均有統(tǒng)計學意義，說明時間因素的作用隨分組的不同而不同。

各組組間效應兩兩比較結果：與手術前相比，治療前大鼠后足底出現(xiàn)明顯熱痛敏闊值降低，即出現(xiàn)熱痛覺過敏。治療后各時間點，柚皮苷組和地塞米松組PWTL分別比生理鹽水組和治療前基礎值提高(P<0.05)。柚皮苷組和地塞米松組在治療后3、7、14天時，在提高PWTL閾值效果上無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2、圖2。

表2 4組大鼠熱刺激縮足反應潛伏期(PWTL)的變化

*未用藥組相同時間段與其他組兩兩比較P<0.05

#柚皮苷組、地塞米松組、生理鹽水組治療后與治療前比較P<0.05

圖1 4組大鼠機械刺激右后肢足底回縮閾值(50%PWMT)變化

時點：1-手術前；2-治療前；3-治療后1天；4-治療后3天；5-治療后7天；6-治療后14天

圖2 4組大鼠熱刺激縮足反應潛伏期(PWTL)的變化

時點：1-手術前；2-治療前；3-治療后1天；4-治療后3天；5-治療后7天；6-治療后14天

3 討論

腰椎間盤突出引起腰背部痛或下肢疼痛是脊柱外科的常見疾患。對其疼痛機制進行的大量研究表明，除了機械壓迫可以導致神經(jīng)損傷繼而引發(fā)疼痛外，椎間盤突出旁的神經(jīng)根常伴水腫、炎癥等變化[6]。這種神經(jīng)根炎癥反應主要是椎間盤髓核變性，纖維環(huán)破裂后，髓核從破口溢出，擴散至神經(jīng)根。髓核里的糖蛋白和P物質(zhì)以及組織胺的大量釋放對神經(jīng)根產(chǎn)生強烈的化學刺激，引起化學性神經(jīng)根炎，同時髓核也可以引起神經(jīng)發(fā)生免疫炎癥反應，最終導致腰痛和下肢疼痛。抑制炎癥反應是治療椎間盤突出癥所致疼痛的一種思路[7，8]。

柚皮苷是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學中應用最早而且最廣泛的藥物之一。柚皮苷是5，7，4’-三羥基二氫黃酮的衍生物，是骨碎補的主要有效成分。大量實驗研究[9]表明：柚皮苷可以抑制炎癥、鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)，對神經(jīng)細胞有保護作用以及治療血管性疾病。這些特性都具有硬膜外腔注射用藥的優(yōu)勢。本研究結果提示硬膜外腔注射柚皮苷能明顯改善硬膜外腔異體髓核植入大鼠的機械痛閾和熱痛閾，具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，其提高痛閾效果與地塞米松相當，本實驗結果使柚皮苷成為一種潛在的，可能成為臨床微創(chuàng)治療腰椎間盤突出癥的候選藥物之一。

柚皮苷與地塞米松提高機械性痛閾和熱痛閾的效果不同可能有以下兩方面原因：一方面，機械痛和熱痛的發(fā)病機理不同，從而導致柚皮苷和地塞米松發(fā)揮作用的機制不同，這需要在進一步的實驗中探討。另一方面，柚皮苷和地塞米松對機械痛和熱痛差異也可能是兩種藥物達到峰效應的時間不同導致的結果。此外，我們在實驗中也觀察到柚皮苷和地塞米松均能持續(xù)提高機械性痛閾和熱痛閾達14天，推測其機制可能與早期抑制髓核致神經(jīng)根炎癥反應有關。

本實驗研究從動物模型上觀察到，硬膜外腔注射柚皮苷可顯著提高髓核致坐骨神經(jīng)痛大鼠的機械痛閾值和熱痛閾值，具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，有助于緩解椎間盤突出癥的腰腿痛癥狀，為其成為治療腰椎間盤突出所致坐骨神經(jīng)痛新藥提供了實驗依據(jù)。但本實驗亦有不足之處。本實驗對行為學的觀察只觀察至給藥治療后14天，沒有進行更長時間的觀察，對于以上藥物鎮(zhèn)痛作用隨時間改變而變化沒有更深入的認識，其安全性和適應證還有待于大量的基礎和臨床的深入研究。

1 Pinto RZ, Maher CG, Ferreira ML, et al. Epidural corticosteroid injections in the management of sciatica: a systematic review and meta-analysis. Ann Intern Med, 2012,157(12):865-877.

2 Gopinath K, Sudhandiran G. Naringin modulates oxidative stress and inflammation in 3-nitropropionic acid-induced neurodegeneration through the activation of nuclear factor-erythroid 2-related factor-2 signalling pathway. Neuroscience,2012,227(12):134-143.

3 Cuellar JM, Montesano PX, Carstens E．Role of TNF-alpha in sensitization of nociceptive dorsal horn neurons induced by application of nucleus pulposus to L5 dorsal root ganglion in rats．Pain,2004,110(3):578-587．

4 Zimmermann M.Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals.Pain,1983,16(2):109-110.

5 Hargreaves K,Dubner R,Brown F,et al.A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia.Pain,1988,32(1):77-88.

6 Strong JA, Xie W, Bataille FJ, et al. Preclinical studies of low back pain. Mol Pain, 2013,9(17):1-9.

7 Scaia V, Baxter D, Cook C. The pain provocation-based straight leg raise test for diagnosis of lumbar disc herniation, lumbar radiculopathy, and/or sciatica: a systematic review of clinical utility. J Back Musculoskelet Rehabil, 2012,25(4):215-223.

8 Kandhare AD, Raygude KS, Ghosh P,et al. Neuroprotective effect of naringin by modulation of endogenous biomarkers in streptozotocin induced painful diabetic neuropathy. Fitoterapia, 2012,83(4):650-659.

9 Ribeiro MH. Naringinases: occurrence, characteristics, and applications. Appl Microbiol Biotechnol, 2011,90(6):1883-1895.

(修回日期：2014-03-31)

(責任編輯：王惠群)

EffectsofEpiduralInjectionofNaringinonSciaticaInducedbyLumbarDiscHerniationinRats

FanDongwei,ChenZhongqiang,HouXiaofei.

DepartmentofOrthopaedics,PekingUniversityThirdHospital,Beijing100191,China

ObjectiveTo observe the effects of epidural injection of naringin on the pain-induced behaviors in rats with nucleus pulposus-induced sciatica.MethodsA total of 28 male SD (Sprague Dawley) rats were selected and made into nucleus pulposus-induced sciatica models. The rats were randomly and evenly divided into 4 groups (7 rats per group): naringin group (A), dexamethasone group (B), normal saline group (C), and D group. Group A, group B and group C were respectively administrated with naringin, dexamethasone, normal saline (50 μl for each agent) by epidural injection from the 3rdday after operation while group D

no treatment. The pain-induced behavioral responses (50% paw withdrawal mechanical threshold and paw withdrawal thermal latency) were measured on the 1std, 3rdd, 7thd, and 14thd postoperatively.ResultsAll the rats of the 4 groups had significantly higher hyperalgia to mechanical and thermal stimulation compared with preoperation (P<0.05) and there was no significant differences between group A and B (P>0.05) in 50% paw withdrawal mechanical threshold and paw withdrawal thermal latency.ConclusionThe injection of naringin into epidural space can reduce the nucleus pulposus-induced sciatica hyperalgia.

Naringin; Sciatica; Epidural injection

國家自然科學基金資助項目(30801156，81071505)

R-332

：A

：1009-6604(2014)05-0472-04

10.3969/j.issn.1009-6604.2014.05.026

2014-03-13)

**通訊作者，E-mail：chenzq@bjmu.edu.cn