焦霞，朱曉蔚*，蔣小芹，趙國(guó)軍，詹樹(shù)東，劉福興，戴桂紅，肖蔚，姜家寶，于鴻

（泰州市人民醫(yī)院1.病理科，2.普外科，江蘇泰州225300）

NDRG1、P21及VEGF在肺腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

焦霞1，朱曉蔚1*，蔣小芹1，趙國(guó)軍1，詹樹(shù)東1，劉福興1，戴桂紅1，肖蔚1，姜家寶2，于鴻1

（泰州市人民醫(yī)院1.病理科，2.普外科，江蘇泰州225300）

目的：觀察N-myc下游調(diào)節(jié)基因1（N-myc downstream regulated gene1，NDRG1）、P21及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因在肺腺癌中的表達(dá)及在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)20例正常肺組織和94例肺腺癌組織中NDRG1、P21及VEGF蛋白的表達(dá)情況，并分析三者表達(dá)與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果：在正常肺組織及肺腺癌組織中，NDRG1陽(yáng)性率分別為90.0%（18／20）和52.1%（49／94），P21陽(yáng)性率分別為80.0%（16／20）和33.0%（31／94），VEGF陽(yáng)性率分別為20.0%（4／20）和53.2%（50／94），3種蛋白陽(yáng)性率比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。肺腺癌組織中NDRG1、P21及VEGF的表達(dá)與肺腺癌患者年齡、性別、組織分化程度及TNM分期均無(wú)相關(guān)性（P均＞0.05），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析顯示，NDRG1、P21和VEGF表達(dá)與生存明顯相關(guān)（P均＜0.01）。結(jié)論：肺腺癌組織中NDRG1和P21表達(dá)下調(diào)，而VEGF表達(dá)上調(diào)，聯(lián)合檢測(cè)三者的表達(dá)可能對(duì)判斷預(yù)后具有重要價(jià)值。

肺腺癌；N-myc下游調(diào)節(jié)基因1；P21；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

N-myc下游調(diào)節(jié)基因1（N-myc downstream regulated gene1，NDRG1）是Stanton等［1］在N-myc敲除的小鼠胚胎組織中發(fā)現(xiàn)的，與細(xì)胞增殖及分化密切相關(guān)，可被多種生理或病理因素誘導(dǎo)和調(diào)控，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，NDRG1在宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)降低或缺失，有望成為一個(gè)新的候選抑癌基因，已引起越來(lái)越多研究者的重視［2］。然而，迄今對(duì)于NDRG1在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制及臨床意義尚不十分明確。為此，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察肺腺癌組織和正常肺組織中NDRG1、P21及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，分析三者陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2005年1月至2009年12月泰州市人民醫(yī)院胸外科手術(shù)切除肺腺癌蠟塊標(biāo)本94例，男56例，女38例，年齡34～86歲，平均56歲，其中＜55歲30例，≥55歲64例；所有病例均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為腺癌，高分化16例，中分化51例，低分化27例。根據(jù)2009年國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)制定的TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，Ⅰ期40例，Ⅱ期36例，Ⅲ期18例。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例。所有病例術(shù)前均未經(jīng)放療、化療。收集20例正常肺組織作為對(duì)照。

1.2 方法

免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白過(guò)氧化酶復(fù)合物法（S-P法）。羊抗人NDRG1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，鼠抗人P21單克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體購(gòu)自丹麥Dako公司，具體操作流程按說(shuō)明書進(jìn)行，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：NDRG1蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)；VEGF以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)均勻棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)；P21陽(yáng)性信號(hào)定位于胞核，棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和著色強(qiáng)度用半定量積分法判斷結(jié)果，每張切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；著色強(qiáng)度：細(xì)胞不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者積分相乘，0～4分為陰性，5～12分為陽(yáng)性［3－4］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2檢驗(yàn)分析肺腺癌組織與正常肺組織中NDRG1、P21和VEGF的表達(dá)及肺腺癌組織中三者表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。采用Spearman相關(guān)系數(shù)計(jì)算肺腺癌組織中三者陽(yáng)性率的相關(guān)性。生存分析采用Kaplan-Meier方法，Log-rank檢驗(yàn)法分析生存率差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織中NDRG1、P21及VEGF的表達(dá)

正常肺組織肺泡上皮中NDRG1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為90.0%（18／20），肺腺癌組織中NDRG1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為52.1%（49／94）。與正常肺組織相比，肺腺癌組織中NDRG1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（χ2＝9.762，P＝0.002）。正常肺組織中肺泡上皮P21陽(yáng)性表達(dá)率為80.0%（16／20），肺腺癌組織中P21陽(yáng)性表達(dá)率為33.0%（31／94）。與正常肺組織相比，肺腺癌組織中P21表達(dá)明顯下調(diào)（χ2＝13.170，P＝0.001）。正常肺組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為20.0%（4／20），肺腺癌組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為53.2%（50／94）。與正常肺組織相比，肺腺癌組織中VEGF表達(dá)明顯上調(diào)（χ2＝6.017，P＝0.014）。見(jiàn)圖1。

2.2 NDRG1、P21及VEGF的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

肺腺癌組織中NDRG1、P21及VEGF的表達(dá)與患者年齡、性別、組織分化程度及TNM分期均無(wú)相關(guān)性（P均＞0.05），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 肺腺癌組織中NDRG1、P21和VEGF表達(dá)的相關(guān)性分析

94例肺腺癌組織中，22例NDRG1與P21同時(shí)呈陽(yáng)性表達(dá)，40例同時(shí)呈陰性表達(dá)；17例NDRG1與VEGF同時(shí)呈陽(yáng)性表達(dá)，16例同時(shí)呈陰性表達(dá)；10例VEGF與P21同時(shí)呈陽(yáng)性表達(dá)，23例同時(shí)呈陰性表達(dá)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，NDRG1與P21在肺腺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.324，P＝0.001），NDRG1與VEGF在肺腺癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.296，P＝0.002），VEGF與P21在肺腺癌 中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.294，P＝0.002）。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)NDRG1、P21和VEGF在肺腺癌組織和正常肺組織中的表達(dá)（SP×200）

表1 NDRG1、P21及VEGF在肺腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 肺腺癌組織中NDRG1、P21和VEGF表達(dá)與腫瘤預(yù)后的關(guān)系

94例肺腺癌患者中80例獲得隨訪資料，電話隨訪5年，38例患者死亡，整體5年存活率為52.5%?？偲骄鏁r(shí)間為43.74個(gè)月，總中位生存時(shí)間為43個(gè)月。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織中NDRG1及P21表達(dá)陽(yáng)性者較陰性者生存期長(zhǎng)，而VEGF表達(dá)陽(yáng)性者較陰性者生存期縮短。見(jiàn)圖2。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，NDRG1在乳腺癌、宮頸癌、肝癌等組織及人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人結(jié)腸癌SW62細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯降低［5］。Fotovati等［6］報(bào)道，乳腺癌組織內(nèi)NDRG1表達(dá)明顯降低，且表達(dá)水平越低癌轉(zhuǎn)移率越高、患者生存時(shí)間越短。Li等［7］將NDRG1導(dǎo)入高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌SW620細(xì)胞系中，觀察到其體外侵襲能力及在裸鼠體內(nèi)肝臟轉(zhuǎn)移能力明顯降低，提示NDRG1是一種轉(zhuǎn)移抑制基因。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺腺癌組織中的NDRG1表達(dá)明顯低于正常肺組織，證實(shí)NDRG1在肺腺癌組織內(nèi)表達(dá)明顯減少。本研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的NDRG1陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示NDRG1表達(dá)減少與肺腺癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

圖2 NDRG1、P21、VEGF表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系（Kap lan-M eier生存分析）

P21蛋白是目前已知的具有廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白，其過(guò)表達(dá)致細(xì)胞周期阻滯于G1期、G2期或S期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Kovacevic等［8］將NDRG1基因?qū)肴饲傲邢侔㏄C3MM細(xì)胞株和肺癌H1299細(xì)胞株，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力均降低，其機(jī)制可能與NDRG1通過(guò)非P53依賴性信號(hào)通路在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)P21的表達(dá)有關(guān)。我們前期采用脂質(zhì)體介導(dǎo)將NDRG1基因轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞P21表達(dá)也上調(diào)，細(xì)胞增殖水平明顯降低而細(xì)胞凋亡明顯增加，其機(jī)制可能與NDRG1上調(diào)A549細(xì)胞P21的表達(dá)有關(guān)［9］。VEGF是目前已知作用最強(qiáng)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，主要功能是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)新生血管形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。研究顯示，體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞、動(dòng)物模型的肺癌組織及人肺癌組織中VEGF均呈高表達(dá)［10］。Hosoi等［11］報(bào)道，上調(diào)胰腺癌與肺腺癌細(xì)胞內(nèi)NDRG1基因的表達(dá)，癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力明顯降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NDRG1和P21蛋白在肺腺癌中表達(dá)下調(diào)，而VEGF表達(dá)上調(diào)，NDRG1和P21陽(yáng)性表達(dá)患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較低，NDRG1、P21和VEGF表達(dá)與患者預(yù)后明顯相關(guān)。因此，我們認(rèn)為NDRG1、P21和VEGF在肺腺癌中表達(dá)的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)判斷肺腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有一定意義。同時(shí)，肺腺癌組織中NDRG1、P21與VEGF的表達(dá)具有相關(guān)性，提示NDRG1可能與P21、VEGF協(xié)同作用，參與肺腺癌發(fā)生和發(fā)展。

［1］Stanton BR，Perkins AS，Tessarollo L，etal.Loss of N-myc function results in embryonic lethality and failure of the epithelial component of the embryo to develop［J］.Genes Dev，1992，6（12A）：2235－2247.

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Expression of NDRG1，P21 and VEGF in lung adenocarcinoma tissue and its clinical significance

JIAO Xia1，ZHU Xiao-wei1，JIANG Xiao-qin1，ZHAO Guo-jun1，ZHAN Shu-dong1，LIU Fu-xing1，DAIGui-hong1，XIAOWei1，JIANG Jia-bao2，YU Hong1
（1.Department of Pathology，2.Department of General Surgery，Taizhou People′s Hospital，Taizhou Jiangsu 225300，China）

Objective：To observe the expression of N-myc downstream regulated gene1（NDRG1），P21 and vascular endothelial growth factor（VEGF）in lung adenocarcinoma tissue，and to elucidate themechanism of lung adenocarcinoma invasion and metastasis.M ethods：The expressions of NDRG1，P21 and VEGF were detected by immunohistochemistry in 20 cases of normal lung tissue and in 94 cases of lung adenocarcinoma tissue.The correlation among NDRG1，P21 and VEGF expressions in lung adenocarcinoma tissue was investigated by Spearman rank correlation analysis.The relationship between NDRG1 expression and clinicopathological characteristics was investigated by Kaplan-Meier survival curve analysis.Results：In normal lung tissue and lung adenocarcinoma tissue，the positive immunoreactivity rate of NDRG1 was 90.0%（18／20）and 52.1%（49／94），respectively；P21 was 80.0%（16／20）and 33.0%（31／94），respectively；VEGF was 20.0%（4／20）and 53.2%（50／94），respectively.The expressions of NDRG1 and P21 was negatively correlated with lymphaticmetastasis，while the expression of VEGFwas positively correlated with lymphatic metastasis.Univariate survival analysis indicated that the expressions of NDRG1，P21 and VEGF were associated with patient survival.Conclusion：The expressions of NDRG1 and P21 in lung adenocarcinoma tissuewere down-regulated while VEGF expression was up-regulated.The joint detection of NDRG1，P21 and VEGFmight provide some guiding significance to judge the prognosis of lung adenocarcinoma.

book=347,ebook=76

lung adenocarcinoma；N-myc downstream regulated gene 1；P21；vascular endothelial growth factor

R734.2

A

1671－7783（2014）04－0346－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140102

江蘇省六大人才基金資助項(xiàng)目（2011-WS-023）；泰州市人民醫(yī)院重大科研資助項(xiàng)目（201008）

焦霞（1979—），女，江蘇泰州人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事肺腫瘤研究；肖蔚（通訊作者），教授，主任醫(yī)師，E-mail：yuhongmiaomiao＠163.com

*：共同第一作者

2014－04－15 ［編輯］劉星星