王寧寧，花茂方

（1.連云港市第一人民醫(yī)院婦科，江蘇連云港222000；2.連云港市婦幼保健醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇連云港222000）

張潤娉，李建平

（蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇蘇州215129）

子宮頸環(huán)形電切術(shù)及冷刀錐切術(shù)治療宮頸上皮內(nèi)瘤變2～3級效果比較

王寧寧1，花茂方2

（1.連云港市第一人民醫(yī)院婦科，江蘇連云港222000；2.連云港市婦幼保健醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇連云港222000）

目的：比較宮頸冷刀錐切術(shù)（cold knife conization，CKC）和宮頸環(huán)行電切除術(shù)（loop electrosurgical excision procedure，LEEP）治療宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）2～3級的臨床價值。方法：回顧性分析172例CIN 2～3級患者的臨床資料，通過觀察CKC和LEEP兩種宮頸錐切術(shù)治療CIN 2～3級的臨床療效，比較二者的臨床價值。結(jié)果：與CKC組相比，LEEP組手術(shù)時間短，術(shù)中平均出血量少，術(shù)后出血發(fā)生率及宮頸管黏連率低，術(shù)后病變復(fù)發(fā)率高，術(shù)后高危人乳頭瘤病毒（HPV）清除率低（P均＜0.05）。CKC組術(shù)后病灶殘留率低于LEEP組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。兩組患者手術(shù)后高危HPV感染均較術(shù)前明顯下降。術(shù)后病理顯示，LEEP組病變復(fù)發(fā)患者均為CIN 3級，80%標本為多象限受累，病變殘留占60%。結(jié)論：LEEP手術(shù)時間短、術(shù)中出血少、術(shù)后并發(fā)癥少，但在減少復(fù)發(fā)（尤其是病變級別高，標本多象限受累的情況）及高危HPV持續(xù)感染方面不及CKC，因此LEEP尚不能完全取代傳統(tǒng)的CKC。

宮頸上皮內(nèi)瘤變；宮頸冷刀錐切術(shù)；宮頸環(huán)形電切除術(shù)

子宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是與子宮頸浸潤癌密切相關(guān)的一組子宮頸病變，常發(fā)生于25～35歲女性。大部分低級別CIN可自行消退，但高級別CIN具有癌變潛能，可發(fā)展為浸潤癌，被視為癌前病變。約60%CIN 1級會自然消退，約20%CIN 2級會發(fā)展為CIN 3級，5%發(fā)展為浸潤癌。故所有的CIN 2級、3級均需要治療。CIN反映了子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的連續(xù)過程，通過篩查及時發(fā)現(xiàn)CIN和治療高級別病變，是預(yù)防子宮頸癌行之有效的措施。陰道鏡檢查滿意的CIN 2級可用物理治療或子宮頸錐切術(shù)；陰道鏡檢查不滿意的CIN 2級和所有的CIN 3級通常采用子宮頸錐切術(shù)，包括子宮環(huán)形電切術(shù)（loop electrosurgical excision procedure，LEEP）和冷刀錐切術(shù)（cold knife conization，CKC）［1］。本研究通過對CKC和LEEP治療CIN 2～3級臨床療效的觀察及對比，探討兩種宮頸錐切術(shù)治療CIN 2～3級的臨床價值。

1 對象與方法

1.1 病例

回顧性分析2010年1月至2013年6月在連云港市第一人民醫(yī)院及連云港市婦幼保健醫(yī)院門診經(jīng)薄層液基細胞學(xué)檢查（thinprep cytologic test，TCT）、陰道鏡輔助下行宮頸多點活檢術(shù)＋頸管診刮術(shù)，經(jīng)過病理檢查，診斷為CIN 2～3級的已婚患者172例，年齡23～57歲，平均年齡42.6歲，高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）檢測均為陽性。隨機分為2組，其中，行CKC 112例，行LEEP 60例。兩組患者年齡、妊娠次數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；均于月經(jīng)干凈3～7 d后手術(shù)；宮頸錐切術(shù)前均行血常規(guī)，血凝常規(guī)，白帶常規(guī)，肝腎功能，心電圖檢查，均無手術(shù)禁忌證。術(shù)后隨訪1～2年。

1.2 方法

1.2.1 CKC操作方法 患者術(shù)前行腰麻、腰硬聯(lián)合或全身麻醉，取膀胱截石位，常規(guī)消毒大腿內(nèi)上1／3，外陰和陰道鋪無菌巾。再次消毒陰道、宮頸，置入窺陰器擴張陰道顯露宮頸。用宮頸鉗鉗夾宮頸前唇外壁或用7號絲線縫宮頸前后唇做牽引。探查宮腔了解子宮位置及深度。于宮頸3點、9點近穹窿處黏膜下注射垂體后葉素稀釋液（6 U溶于30～50 mL生理鹽水）或1∶300腎上腺素鹽水以防出血（心血管疾病患者忌用）。宮頸表面涂碘液，觀察碘染部位和范圍。用小尖刀在宮頸表面碘不著色區(qū)外0.3～0.5 cm處做一環(huán)形切口，一般以30～50°斜向頸管行宮頸錐形切除，切除深度一般為2～2.5 cm，不超過宮頸內(nèi)口，切除的宮頸呈圓錐狀。宮頸殘端處理采用Sturmdorf改良縫合法［2］，以1-0可吸收線行宮頸殘端縫合，使宮頸成型。錐切較淺，出血不多時可不縫合，用凝血紗布或明膠海綿加止血粉貼于創(chuàng)面，碘仿紗條或紗布填塞，壓迫止血，48 h后取出。術(shù)畢用探針和小號擴張器探宮腔深度和擴張宮頸管。陰道內(nèi)填塞紗布壓迫止血，術(shù)后平臥，保留導(dǎo)尿48～72 h。術(shù)后第5天出院。

1.2.2 LEEP操作方法 取膀胱截石位，常規(guī)消毒大腿內(nèi)上1／3，外陰及陰道鋪無菌巾。再次消毒陰道、宮頸，置入窺陰器擴張陰道顯露宮頸。于宮頸3、6、9點注射2%利多卡因進行局部麻醉。宮頸表面涂碘液，明確病變范圍。采用美國WALLACH公司生產(chǎn)的高頻電刀，電切割輸出功率為50W，電凝止血輸出功率為25W，采用環(huán)形電極、條形電極或球形電極等切割、止血。觀察病變大小選擇合適的電切環(huán)型號，以單次切除整個病變和移行帶為標準，自不著色區(qū)域外0.3 cm處，宮頸12點處切入，電環(huán)順時針方向勻速切除病灶。切除宮頸管深度根據(jù)具體情況而定，一般錐高1.5～2.0 cm。術(shù)中出血極少，電凝止血效果滿意。創(chuàng)面用無菌紗布壓迫24 h后取出。CKC及LEEP兩組術(shù)后標本12點處縫線標記后均行病理學(xué)檢查。

1.2.3 術(shù)后處理及并發(fā)癥 術(shù)后1周內(nèi)禁止劇烈活動，保持外陰清潔，禁止性生活及盆浴3個月，CKC組術(shù)后靜滴抗生素3～4 d，LEEP組術(shù)后口服抗生素3 d。觀察兩組可能出現(xiàn)的并發(fā)癥：術(shù)后陰道大量出血（相當或多于月經(jīng)量）、感染及宮頸口黏連，出現(xiàn)并發(fā)癥的患者應(yīng)及時對癥治療。

1.2.4 隨訪 所有患者均為門診隨訪。隨訪時間為術(shù)后第1年每3月1次，第2年每半年1次，兩年內(nèi)如無異常，每年1次。隨訪內(nèi)容為所有患者均行TCT檢查，高危HPV檢測；如TCT異常，行陰道鏡下宮頸活檢術(shù)及病理學(xué)檢查。

1.2.5 觀察指標 觀察兩組的手術(shù)時間、術(shù)中出血量、術(shù)后出血發(fā)生率、術(shù)后宮頸管黏連率、高危HPV清除率、術(shù)后病灶殘留率、復(fù)發(fā)率。術(shù)后3月發(fā)現(xiàn)CIN為手術(shù)病灶殘留；手術(shù)后無CIN病灶殘留，半年后發(fā)現(xiàn)CIN為病變復(fù)發(fā)；術(shù)后半年檢查無CIN為治愈。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間手術(shù)時間和術(shù)中平均出血量的比較采用t檢驗，兩組術(shù)后陰道大出血、術(shù)后宮頸黏連、術(shù)后殘留、術(shù)后病變復(fù)發(fā)率的比較采用Fisher′s確切概率法，兩組間高危HPV清除率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組術(shù)中情況比較

LEEP組平均手術(shù)時間，術(shù)中平均出血量均明顯優(yōu)于CKC組（P均＜0.01）。見表1。

表1 兩組術(shù)中情況比較 ±s

表1 兩組術(shù)中情況比較 ±s

組別 n 手術(shù)時間（min）術(shù)中平均出血量（mL）112 24.00±5.26 28.02±4.81 LEEP組 60 5.00±2.66 6.07±3.69 t值CKC組26.32 30.83 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.2 兩組術(shù)后并發(fā)癥觀察指標比較

結(jié)果顯示，CKC組術(shù)后陰道大出血、術(shù)后宮頸黏連等發(fā)生率均高于LEEP組（P均＜0.05）；兩組術(shù)后殘留相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 兩組治療效果的比較

見表3。CKC組術(shù)后病變復(fù)發(fā)率明顯低于LEEP組（P＜0.05），但高危HPV清除率則高于LEEP組（P＜0.01）。由于術(shù)前兩組高危HPV感染均為陽性，術(shù)后CKC組高危HPV感染率降為8.93%（10／112），LEEP組高危HPV感染率降為26.67%（16／60），均較術(shù)前大幅度下降。病理檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組病變復(fù)發(fā)患者均為CIN 3級，LEEP組5例復(fù)發(fā)患者中3例為術(shù)后殘留者，占60%，LEEP組復(fù)發(fā)患者中80%為標本多象限受累。

表2 兩組術(shù)后并發(fā)癥情況比較

表3 兩組治療效果的比較

3 討論

近年來，隨著宮頸細胞學(xué)檢查的大規(guī)模開展與普及和陰道鏡下活檢的聯(lián)合應(yīng)用，CIN及宮頸癌的檢出逐年增多，且發(fā)病年齡日趨年輕化。由于CIN本身并不具有惡性腫瘤的生物學(xué)特性，所以其治療完全是去除病灶而不過度損傷正常的宮頸組織［3］。2001年美國陰道鏡和宮頸病理協(xié)會（ASCCP）推薦的CIN 2～3級主要治療方法為宮頸錐切術(shù)，包括LEEP和CKC［4］。

CKC于1834年由Lisfranc首次報道，我國于20世紀50年代開始應(yīng)用，現(xiàn)已成為一種成熟的治療CIN的經(jīng)典方法［5］。CKC能夠提供足夠的、完整的手術(shù)標本，可較為充分地了解病理分級，病變范圍及程度，既可充分地去除病灶、達到滿意地治療宮頸病變的目的，同時又保留生育功能。LEEP是近20年來發(fā)展起來的一種新型手術(shù)，對組織的高溫破壞極小，避免了影響切口邊緣組織的病理學(xué)檢查［6］。LEEP是采用金屬環(huán)通以高頻電流對宮頸組織進行錐形切除，最早于1981年由Cartier報道，與傳統(tǒng)CKC相比，手術(shù)操作簡便、無需麻醉、出血少、創(chuàng)面無需縫合［5］。

本研究結(jié)果表明，與CKC組相比，LEEP組手術(shù)時間短、術(shù)中出血量少；且LEEP組術(shù)后陰道出血及宮頸黏連等并發(fā)癥發(fā)生率低（P＜0.05）。CIN的治療效果通常從宮頸病灶切除的徹底性和術(shù)后復(fù)發(fā)的情況來評價，術(shù)后觀察病變持續(xù)或復(fù)發(fā)非常重要。目前，評價的常用觀察指標有病灶殘留率、復(fù)發(fā)率、高危HPV清除率等。Huang等［7］研究116例CIN，其中，73例行LEEP術(shù)，43例行CKC術(shù)，6個月后均行子宮切除，結(jié)果顯示LEEP與CKC在術(shù)后殘留方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果顯示，CKC組術(shù)后殘留低于LEEP組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果與Huang等觀點相同。CKC組病變復(fù)發(fā)率明顯低于LEEP組，并且病理顯示，LEEP組病變復(fù)發(fā)患者均為CIN 3級，其中病變殘留占60%，80%為標本多象限受累，提示病變級別高（即CIN3級），標本多象限受累，病變范圍大，病灶殘留，可能導(dǎo)致CIN持續(xù)、復(fù)發(fā)，這與Siriaree等［8］觀點一致。

宮頸癌起源于CIN，兩者病因相同，均為高危型HPV感染所致，接近90%的CIN和99%以上的宮頸癌組織有高危型HPV感染［1］。因此，術(shù)后長期存在的高危型HPV感染勢必增加CIN復(fù)發(fā)的可能。本文結(jié)果表明，兩組患者手術(shù)后高危型HPV感染均較手術(shù)前明顯下降，提示宮頸錐切術(shù)在去除CIN病灶的同時，在很大程度上也能清除病毒感染。CKC組術(shù)后高危型HPV清除率明顯高于LEEP組，提示CKC比LEEP具有更強的病毒清除能力，可能與CKC切除范圍較大有關(guān)。

因此，我們認為LEEP組與CKC組治療效果的差異與下列因素有關(guān)：CIN病變級別高（CIN 3級），病灶呈多象限受累，宮頸病變范圍大的患者，術(shù)后更易復(fù)發(fā)；LEEP術(shù)切除宮頸錐高度一般為1.5～2 cm，手術(shù)范圍較CKC小（切除高度2.0～2.5 cm），取材相對有限，可能遺漏病灶，尤其對CIN病變級別高，病灶呈多象限受累的病灶不易根治，導(dǎo)致HPV病毒持續(xù)感染，清除率低；術(shù)者的操作經(jīng)驗、手術(shù)技巧、手術(shù)方式選擇對治療效果也存在影響?？梢姡珻KC在控制病變復(fù)發(fā)率和提高HPV清除率方面較LEEP更具優(yōu)勢，病變級別高（CIN 3級）、標本多象限受累的患者，宜選擇CKC治療，這與文獻觀點一致［9－10］。

綜上所述，LEEP治療CIN 2～3級具有手術(shù)時間短、術(shù)中出血少、術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率低等優(yōu)勢，但在控制病情復(fù)發(fā)，尤其是因病變級別高（CIN 3級），標本多象限受累而致復(fù)發(fā)可能性大的患者，清除HPV病毒感染等方面存在局限性，無法完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)的CKC。臨床上應(yīng)根據(jù)患者病情特點、病變范圍，合理選擇宮頸錐切術(shù)的方式，進行個體化治療，同時還要不斷提高兩種錐切術(shù)的手術(shù)技巧，既要盡量減小創(chuàng)傷，保留正常組織，又要防止手術(shù)不足造成CIN的殘留或復(fù)發(fā)，高度重視術(shù)后隨訪，才能最大限度地降低手術(shù)對患者生活質(zhì)量及生育功能的影響。

［1］謝幸，茍文麗.婦產(chǎn)科學(xué)［M］.8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：301－304.

［2］張志毅，章文華.現(xiàn)代婦科腫瘤外科學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2003：78.

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阿米洛利通過自噬溶酶體途徑保護PC12細胞

張潤娉，李建平

（蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇蘇州215129）

［摘要］目的：研究酸敏感離子通道阻斷劑阿米洛利對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞株的保護作用及其對自噬溶酶體通路的影響。方法：在PC12細胞模型上，觀察甲基苯基吡啶（methy-phenylpyridi，MPP＋）處理對細胞存活率（MTT檢測）、乳酸脫氫酶（LDH）漏出率、細胞凋亡率的影響，并觀察阿米洛利對MPP＋所致細胞死亡的影響；蛋白質(zhì)印跡法檢測大自噬通路標志蛋白LC3和分子伴侶介導(dǎo)的自噬通路標志蛋白LAMP2a表達水平的變化。結(jié)果：MPP＋導(dǎo)致細胞存活率明顯降低，上清液中LDH漏出率明顯升高，細胞凋亡率升高，抑制大自噬通路標志蛋白LC3-Ⅱ的表達，同時上調(diào)了分子伴侶介導(dǎo)的自噬通路標志性蛋白LAMP2a的表達水平；而阿米洛利可提高細胞存活率，減少上清液中LDH漏出率，降低細胞凋亡率，并能在激活大自噬通路的同時下調(diào)分子伴侶介導(dǎo)的自噬通路的活性。結(jié)論：阿米洛利可能通過抑制酸敏感離子通道的作用拮抗MPP＋誘導(dǎo)的PC12細胞自噬性死亡。

［關(guān)鍵詞］阿米洛利；PC12細胞；MPP＋；自噬 溶酶體通路

DOI：10.13312／j.issn.1671-7783.y1400126

［Abstract］Objective：To evaluate the neuroprotective effects of amiloride；a non-selective blockers of acid-sensing ion channels，on PC12 cells and to view the influence of autophagy-lysosome pathway（ALP）.M ethods：PC12 cells were tested with methy-phenylpyridi（MPP＋），while giving amiloride as interventiong：The cells viabilitywas analyzed by MTT assay；The cells injury was assessed by lactate dehydrogenase（LDH）assay；Flow cytometry was used to study the apoptotic；Western blot analysis was used to study the autophagic mechanisms.Results：MPP＋medium treatment resulted in significantly lower survival rate，the supernatant of LDH leakage was significantly higher，the apoptosis rate increased，the expression of LC3-Ⅱwas inhibited while inducedmore expression of LAMP2a；but amiloride effectively improved the cell survival rate，reduced LDH leakage rate，inhibited apoptosis，and upregulated LC3-Ⅱprotein，which is associated decrease expression of LAMP2a.Conclusion：Amiloride can protect PC12 cells againstMPP＋-induced cell death by autophagic，through inhibition of acid-sensing ion channels activity.

［Key words］amiloride；PC12 cells；MPP＋；autophagy-lysosome pathway

帕金森病是一種常見于中老年人、以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性丟失和紋狀體內(nèi)多巴胺 乙酰膽堿平衡紊亂為特征的神經(jīng)變性疾病。隨著人口老齡化的出現(xiàn)，帕金森病已成為影響人類健康的主要疾病之一。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的異常聚集在帕金森病發(fā)病過程中具有重要作用，而自噬溶酶體途徑（autophagy-lysosome pathway，ALP）是細胞降解蛋白的主要途徑，提高ALP活性可減少帕金森病中異常蛋白的聚集［1］。

酸敏感離子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）為選擇性的離子通道蛋白，表達于中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)，廣泛參與到體內(nèi)炎癥、疼痛、癲癇、腦缺血缺氧、神經(jīng)細胞死亡等病理過程。有研究顯示，在甲基苯基四氫吡啶（methyl-phenyl-tetrahydropyridine，MPTP）誘導(dǎo)的帕金森病模型中應(yīng)用ASICs阻斷劑阿米洛利可發(fā)揮神經(jīng)保護作用［2］，但其機制以及是否與ALP相關(guān)仍不明確。本研究通過環(huán)境毒素甲基苯基吡啶（methy-phenylpyridi，MPP＋）誘導(dǎo)PC12細胞損傷，并給予阿米洛利進行干預(yù)，以探討ASICs和ALP是否與帕金森病的發(fā)病存在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）、阿米洛利為Sigma公司產(chǎn)品；乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒購自南京建成生物科技公司；凋亡試劑盒（488 Annexin V／PI）為Molecular Probes公司產(chǎn)品；MPP＋（Sigma公司）；細胞裂解液、小鼠單克隆抗β-肌動蛋白抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠抗體、ECL發(fā)光劑等均購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔多克隆抗LC3抗體、兔多克隆抗LAMP2a抗體均為Abcam公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

PC12細胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、飽和濕度、37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，隔天換液，生長至80%～90%時傳代培養(yǎng)。實驗前1天，取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔培養(yǎng)板（7 000個／孔）用于MTT測定，或6孔培養(yǎng)板（2×106個／孔）內(nèi)用于LDH檢測、流式細胞儀檢測、蛋白質(zhì)印跡法分析。細胞穩(wěn)定生長24 h后，進行實驗分組：正常對照組換為新鮮培養(yǎng)基；MPP＋組給予MPP＋（0.5 mmol／L）處理；阿米洛利組則在給予MPP＋的同時加入阿米洛利（100μmol／L）藥液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，終止培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測PC12細胞活性

利用活細胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶能將MTT還原成藍紫色結(jié)晶的特性，以結(jié)晶溶解后呈現(xiàn)的顏色深淺反映細胞活性的高低。藥物處理24 h，吸除培養(yǎng)液，PBS清洗1次，每孔加入80μL的新鮮培養(yǎng)基和20 μL的MTT溶液（5 mg／mL），37℃避光孵育2 h，1 mL注射器小心吸除上清，每孔加入150μL的二甲基亞砜（DMSO）至沉淀完全溶解，使用全自動酶標儀于570 nm波長處測光密度值（D值），細胞活性用存活率表示，細胞相對存活率（%）＝（實驗組平均D值／對照組平均D值）×100%（各孔D值需與凋零孔校對）。

1.4 上清液LDH活性的檢測

細胞受損后胞質(zhì)內(nèi)的LDH可漏出到培養(yǎng)液中，通過比色法可計算漏出至培養(yǎng)液內(nèi)的LDH含量。藥物處理細胞24 h后，取上清液，離心（4℃，1 000 r／min）5 min，取上清，棄沉淀。除測定管外，每次實驗均同時測定標準管（以丙酮酸標準品代替樣品）、標準空白管（以雙蒸水代替樣品）以及空白管（無輔酶）。按LDH試劑盒說明書進行操作。全自動酶標儀于440 nm波長處測各管D值。上清液中的LDH活力（U／L）＝［（測定管D值－測定空白管D值）／（標準管D值－標準空白管D值）］×標準品濃度（2μmol／mL）×1 000 mL。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

本實驗使用Annexin V-PI雙染色法測定細胞凋亡。藥物處理PC12細胞24 h后，胰酶消化收集細胞，制成單細胞懸液。離心（4℃，1 000 r／min）5 min棄上清，預(yù)冷PBS洗2次，重懸于100μL結(jié)合緩沖液中，各加入5μL的Annexin V和1μL的PI工作液，常溫避光反應(yīng)15 min，加入300μL結(jié)合緩沖液，輕柔混勻，流式細胞儀檢測約10 000個細胞。計算AV＋細胞（凋亡細胞）百分比。將整個實驗重復(fù)3次，然后進行統(tǒng)計分析。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測LC3和LAMP2a蛋白的表達

藥物處理PC12細胞24 h后，用細胞刮刀收集細胞，離心（4℃，1 000 r／min）5 min棄上清，4℃PBS洗2次，加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白。經(jīng)濃度測定及變性后，取30μg總蛋白進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后分別加入LC3（1∶1 000）、LAMP2a（1∶250）和β-肌動蛋白（1∶1 000）抗體4℃孵育過夜。次日TBST洗3次，加入HRP標記的二抗（1∶1 000）37℃孵育2 h，ECL發(fā)光法顯影于X光膠片上，掃描儀掃描蛋白條帶，Image Tool軟件測定免疫印跡條帶密度。免疫印跡條帶密度＝面積×灰度，每個樣本的條帶密度與同一樣本的β-肌動蛋白進行比較求出比值，整個實驗重復(fù)3次，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 阿米洛利提高MPP＋處理后的PC12細胞的存活率

不同濃度阿米洛利作用于正常PC12細胞后，MTT實驗結(jié)果顯示，200、500μmol／L的阿米洛利可明顯降低細胞活性［細胞存活率分別為85.2± 5.0）%、（39.4±6.7）%］；100μmol／L的阿米洛利組細胞存活率為（94.8±9.7）%，與正常PC12細胞的存活率間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

隨后觀察不同濃度阿米洛利對 MPP＋（0.5mmol／L）處理的PC12細胞存活率的影響，結(jié)果顯示100、150μmol／L的阿米洛利組細胞存活率分別為（88.78±13.6%）和（98.4±8.9）%，明顯高于MPP＋（0.5mmol／L）組PC12細胞存活率［（65.47±9.42）%］，而50μmol／L的阿米洛利組細胞的存活率［（73.18±7.53）%］和MPP＋（0.5mmol／L）組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

最后觀察了100μmol／L阿米洛利對經(jīng)不同濃度MPP＋（0.5、1.0mmol／L）處理的PC12細胞的影響，結(jié)果顯示不同濃度MPP＋均可降低PC12細胞的存活率，而100μmol／L阿米洛利可提高不同濃度MPP＋作用的PC12細胞的存活率。見圖1。

圖1 阿米洛利對不同濃度MPP＋處理的PC12細胞株的保護作用

2.2 阿米洛利降低MPP＋處理的PC12細胞LDH漏出率

對照組細胞上清液中LDH的活性為（423.2± 50.9）U／L，與對照組比較，MPP＋處理細胞24h后，上清液中LDH漏出率明顯增加［（567.3±28.1）U／L，t＝5.893，P＜0.001］，而加入100μmol／L阿米洛利后，LDH漏出率［（383.5±12.4）U／L］明顯低于其他兩組（P＜0.01），提示阿米洛利可有效降低MPP＋誘導(dǎo)的細胞損傷。

2.3 阿米洛利減少MPP＋處理的PC12細胞凋亡率

PC12細胞經(jīng)AnnexinV／PI雙標后，應(yīng)用流式細胞儀檢測凋亡細胞比例。對照組凋亡細胞的比例為（5.8±0.4）%，MPP＋處理細胞24h后，細胞凋亡率升高至（44.3±8.5）%，與對照組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.920，P＜0.05）。給予100μmol／L的阿米洛利后，細胞凋亡率為（21.7±1.5）%，與MPP＋組比較，明顯降低（t＝6.965，P＜0.01）。

2.4 阿米洛利上調(diào)PC12細胞LC3-Ⅱ蛋白的表達

MPP＋處理后，PC細胞中LC3蛋白的表達水平明顯降低，提示大自噬通路的活性受到抑制；阿米洛利干預(yù)組LC3-Ⅱ的表達增多，提示阿米洛利可拮抗MPP＋導(dǎo)致的大自噬抑制作用（圖2）。

圖2 各組PC12細胞LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平

2.5 阿米洛利下調(diào)MPP＋處理的PC12細胞LAMP2a蛋白表達

與對照組比較，MPP＋處理明顯誘導(dǎo)了LAMP2a表達的上調(diào)，提示分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperonemediatedautophagy，CMA）途徑的激活；阿米洛利逆轉(zhuǎn)了這一病理改變，使LAMP2a的表達明顯降低，提示其有效抑制了CMA途徑的異常激活（圖3）。

3 討論

ALP為胞內(nèi)蛋白降解的主要途徑，分為大自噬（即一般所指自噬）、CMA和小自噬。對異常蛋白清除機制的研究多集中于大自噬及CMA兩種，大自噬激活常伴隨CMA活性下降［3］。LC3為大自噬的特異性標志蛋白，可分為可溶性（LC3-Ⅰ）和膜性（LC3-Ⅱ），后者能穩(wěn)定結(jié)合在自噬體膜上，存在于自噬體形成的各個階段，反應(yīng)大自噬的活動；LAMP2a可識別由CMA特異性識別的異常蛋白，并介導(dǎo)該蛋白進入溶酶體腔內(nèi)，可反應(yīng)CMA的活性。自噬降解胞內(nèi)成分無明顯的選擇性，主要清除彌散分布于胞質(zhì)內(nèi)的異常蛋白［4］，并且這種清除作用獨立于其他蛋白降解系統(tǒng)［5］。不同條件下，自噬既可以作為一種防御機制清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細胞器、代謝產(chǎn)物，進行亞細胞水平上的重構(gòu)，保護受損的細胞，同時也作為一種細胞死亡程序誘導(dǎo)細胞的主動性死亡。

圖3 各組PC12細胞LAMP2a蛋白的表達水平

近年的研究發(fā)現(xiàn)，異常蛋白聚集在帕金森病發(fā)病過程中具有重要作用［6－7］。帕金森病患者大腦神經(jīng)元胞質(zhì)中存在大量由泛素化蛋白聚集形成的包涵體，有研究顯示胞質(zhì)內(nèi)包涵體本身不會導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變，與其形成密切相關(guān)的異常蛋白的彌漫存在才是導(dǎo)致神經(jīng)元退變的主要原因［4］。應(yīng)用了自噬誘導(dǎo)劑的PC12細胞中可觀察到LC3-Ⅱ表達明顯增多，同時觀察到各種形式的α-突觸核蛋白均明顯減少，提示誘導(dǎo)自噬可減少α-突觸核蛋白聚集，提高細胞存活率［1，8］。

對帕金森病發(fā)病機制的研究還發(fā)現(xiàn)ASICs在帕金森病的發(fā)病中具有重要作用。比如Pakin基因突變可導(dǎo)致常染色體遺傳的帕金森病，pakin蛋白正常情況下可抑制ASICs激活，選擇性敲除小鼠海馬神經(jīng)元Pakin基因可增強ASICs電流，促成多巴胺能神經(jīng)元興奮性中毒而死亡［9－10］；小鼠中腦切片可見大量ASICs表達，抑制ASICs可減少帕金森病細胞模型中α-突觸核蛋白的過度表達［11］。帕金森病、亨廷頓病患者及動物模型腦內(nèi)存在明顯的組織酸化現(xiàn)象，阻斷ASIC1a（ASICs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要表達亞型）的激活或降低其表達均可起到一定的神經(jīng)保護作用［2，12－13］。

以上發(fā)現(xiàn)提示，ASICs和自噬在帕金森病發(fā)病過程中可能存在協(xié)同作用，但缺乏直接的實驗證據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，給予MPP＋誘導(dǎo)的帕金森病細胞模型ASICs非選擇性抑制劑阿米洛利可明顯提高細胞存活率，蛋白質(zhì)印跡法分別檢測大自噬和CMA相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和LAMP2a，結(jié)果顯示阿米洛利能上調(diào)LC3-Ⅱ的表達和抑制LAMP2a的過度表達。該研究結(jié)果提示ASICs可能參與了ALP途徑，而使用ASICs抑制劑可改善自噬受損。

總之，自噬是細胞器和蛋白降解的主要途徑，對成熟神經(jīng)元具有重要的作用，與很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括神經(jīng)退行性疾?。?4］、缺血性腦血管?。?5］、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、癲癇［16］、惡性腫瘤以及肌肉疾病相關(guān)。因此，研究ASICs與自噬的關(guān)系以及通過ASICs調(diào)節(jié)自噬功能具有廣泛研究及臨床應(yīng)用價值。

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［收稿日期］2014－05－13 ［編輯］陳海林

Comparison of loop electrosurgical excision procedure and cold knife conization in the treatment of cervical intraepithelial neoplasia 2-3

WANG Ning-ning1，HUAMao-fang2
（1.Department of Gynecology，the First People′s Hospital，Lianyungang Jiangsu 222000；2.Department of Gynecology and Obstetrics，Lianyungang Maternal and Child Health Hospital，Lianyungang Jiangsu 222000，China）

Objective：To evaluate the clinical effects of cold knife conization（CKC）and loop electrosurgical excision procedure（LEEP）in the treatment of cervical intraepithelial neoplasia 2-3（CIN2-3）.M ethods：A retrospective analysis of the clinical datawas carried out in 172 caseswith CIN 2-3.The clinical effects of CKC and LEEP on the treatment of CIN 2-3 were compared and evaluated.Results：Compared with the CKC group，the LEEP group had shorter operation time，less average intraoperative blood loss，lower rate of postoperative bleeding and cervical adhesion，higher postoperative recurrent rate，and lower risk HPV clearance rate after operation（both P＜0.05）.Although the rate of residual disease after operation in CKC group was lower than that in the LEEP group，the difference was not statistically significant（P＞0.05）.Postoperative pathology showed the relapsed patients in the LEEP group were all CIN 3，80%samples ofmulti quadrant involvement，residual lesions accounted for 60%.Conclusion：LEEP was super selection to CKCwith fewer blood loss，shorter operation time，and fewer postoperative complications；but LEEP was inferior to CKC in reducing recurrent rate（especially in high grade lesion level，specimen with multiquadrant involvement），and persistenthigh-risk HPV infection.So CKC still couldn'tbe replaced completely by LEEP.

cervical intraepithelial neoplasia；cold knife conization；loop electrosurgical excision procedure

Am iloride protects PC12 cells from MPP＋induced injury via autophagy-lysosome pathway

ZHANG Run-ping，LIJian-ping
（Department of Neurology，Suzhou New District People′s Hospital，Suzhou Jiangsu 215129，China）

R713.42

A

1671－7783（2014）04－0355－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140130

王寧寧（1973—），女，湖北棗陽人，副主任醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤的研究。

2014－05－22 ［編輯］劉星星

［中圖分類號］R971

A［文章編號］1671－7783（2014）04－0359－04

［作者簡介］張潤娉（1986—），女，河南羅山人，醫(yī)師，主要從事老年神經(jīng)內(nèi)科疾病研究。