熊御云，王蓓，陶真，吳玲，尤海燕，王文紅，焦志軍

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.風(fēng)濕科，江蘇鎮(zhèn)江212001；3.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)

熊御云1，王蓓1，陶真1，吳玲2，尤海燕1，王文紅3，焦志軍1

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.風(fēng)濕科，江蘇鎮(zhèn)江212001；3.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：探討糖酵解相關(guān)基因在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中的表達(dá)及其意義。方法：選取活動(dòng)期RA患者19例，穩(wěn)定期RA患者23例，采用Ficoll法分離PBMC，定量PCR檢測(cè)糖酵解相關(guān)基因表達(dá)水平，并與健康對(duì)照進(jìn)行比較。結(jié)果：與健康對(duì)照相比，活動(dòng)期RA患者PBMC中糖酵解相關(guān)基因丙糖磷酸異構(gòu)酶（triosephosphate isomerase，TPI）、烯醇化酶（enolase，ENO）、M型丙酮酸激酶（pyruvate kinasemuscle，PKM）、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（monocarboxylic acid transportermember，MCT）表達(dá)量均增加（P＜0.05），穩(wěn)定期RA患者4種基因的表達(dá)略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：RA患者存在糖酵解相關(guān)基因表達(dá)的改變。糖酵解反應(yīng)有可能在RA疾病機(jī)制中具有重要的意義。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；定量PCR；糖酵解相關(guān)基因；外周血單個(gè)核細(xì)胞

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因不明的慢性全身性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征。研究發(fā)現(xiàn)RA患者的滑膜細(xì)胞中糖酵解活性增強(qiáng)［1］，但尚未見有關(guān)RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中糖酵解相關(guān)基因表達(dá)研究的報(bào)道。本研究采用定量PCR分析糖酵解相關(guān)基因如丙糖磷酸異構(gòu)酶（triosephosphate isomerase，TPI）、烯醇化酶（enolase，ENO）、M型丙酮酸激酶（pyruvate kinase muscle，PKM）、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（monocarboxylic acid transportermember，MCT）等基因的表達(dá)，以期為研究糖酵解在RA疾病過(guò)程中的作用提供初步的信息。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

本院活動(dòng)期RA患者19例（均為女性，年齡45～68歲，平均58歲），穩(wěn)定期RA患者23例（均為女性，年齡39～71歲，平均52歲），均嚴(yán)格按照2010年ACR／EULAR診斷分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選?；顒?dòng)程度按照患者疲勞的嚴(yán)重性，晨僵持續(xù)的時(shí)間，關(guān)節(jié)疼痛和腫脹的程度，關(guān)節(jié)壓痛和腫脹的數(shù)目，關(guān)節(jié)功能受限制程度以及實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)（如血沉、C反應(yīng)蛋白、類風(fēng)濕因子和抗CCP抗體檢測(cè)）等進(jìn)行判斷。年齡和性別相匹配的21例健康獻(xiàn)血員（均為女性，年齡50～69歲，平均61歲）作為健康對(duì)照組。

1.2 主要試劑

淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，RNA抽提試劑Trizol為L(zhǎng)ife Technologies公司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT-PCR和PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 PBMC的分離 靜脈血5 mL EDTA抗凝，采用Ficoll密度梯度離心分離法分離PBMC，1 500 r／min離心20 min吸取中間PBMC（白色云霧層），加PBS洗滌細(xì)胞2次，1 500 r／min離心10 min，棄上清，加1 mL Trizol充分溶解，－70℃冰箱保存。

1.3.2 總RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) PBMC中總RNA的提取利用Trizol試劑進(jìn)行。按照Prime-ScriptTMRT-PCR試劑盒的操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。

1.3.3 定量PCR檢測(cè)糖酵解相關(guān)基因mRNA表達(dá)

采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR操作。引物由上海英駿生物工程有限公司合成，糖酵解相關(guān)基因及內(nèi)參引物序列見表1。表達(dá)水平以其與內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白的比值表示，定量PCR儀型號(hào)為Stratagene公司Mx3000P。

表1 糖酵解相關(guān)基因及內(nèi)參引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Nemenyi法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA患者PBMC中TPI mRNA的表達(dá)

如圖1所示，TPI mRNA在RA患者與健康對(duì)照組PBMC中均有表達(dá)?；顒?dòng)期RA患者中TPI mRNA表達(dá)水平比健康對(duì)照組明顯增高，增加了約6.6倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4.994，P＜0.05）。穩(wěn)定期RA患者與健康對(duì)照組相比TPI mRNA略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者PBMC中TPI mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

2.2 RA患者PBMC中ENO mRNA的表達(dá)

如圖2所示，活動(dòng)期RA患者中ENO mRNA表達(dá)水平比健康對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝9.603，P＜0.05），穩(wěn)定期RA患者與健康對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者PBMC中ENO mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

2.3 RA患者PBMC中PKM mRNA的表達(dá)

如圖3所示，活動(dòng)期RA患者PKM mRNA表達(dá)水平比健康對(duì)照組增加了154倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝19.134，P＜0.001）。穩(wěn)定期RA患者PB-MC中PKM的表達(dá)與健康對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者PBMC中PKM m RNA的相對(duì)表達(dá)水平

2.4 RA患者PBMC中MCT mRNA的表達(dá)

如圖4所示，MCT mRNA在RA患者與健康對(duì)照組PBMC中均表達(dá)?；顒?dòng)期RA患者的MCT mRNA表達(dá)水平與健康對(duì)照組相比增加了52倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5.017，P＜0.05）。穩(wěn)定期RA患者與健康對(duì)照組中MCT的表達(dá)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者PBMC中MCT m RNA的相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

葡萄糖代謝不但能夠?yàn)樯砘顒?dòng)提供能量，同時(shí)也能通過(guò)代謝基質(zhì)組成復(fù)雜的信號(hào)途徑。糖酵解是葡萄糖代謝的一種方式，能夠催化一分子葡萄糖產(chǎn)生2分子乳酸和2分子ATP。葡萄糖代謝在糖尿病、卒中、精神分裂癥和藥物濫用中發(fā)揮著重要的作用［2］。目前對(duì)RA的研究主要集中于免疫、遺傳和細(xì)胞生物學(xué)等方面，而對(duì)葡萄糖代謝的研究目前報(bào)道較少。近年，一些研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖代謝在RA的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。Henderson等［1］發(fā)現(xiàn)RA滑膜細(xì)胞中3-磷酸甘油醛脫氫酶和乳酸脫氫酶活性增高，說(shuō)明RA滑膜組織中糖酵解活性增高。糖酵解速率的升高導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酸環(huán)境的產(chǎn)生，這種酸化微環(huán)境有可能破壞了RA滑膜組織中異常細(xì)胞的分化［3］。Yang等［4］已在RA患者外周血CD4＋T細(xì)胞中觀察了糖酵解的活性狀態(tài)。本研究利用Ficoll分離人PBMC，從方法學(xué)上簡(jiǎn)化了Yang等需分離CD4＋T細(xì)胞的操作步驟，同時(shí)全面分析外周血單個(gè)核細(xì)胞中包含的所有T、B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)情況。

本研究結(jié)果顯示，活動(dòng)期RA患者糖酵解相關(guān)基因TPI、ENO、PKM及MCT表達(dá)均明顯高于穩(wěn)定期RA患者和健康對(duì)照人群，而穩(wěn)定期患者雖然在總體上略高于健康對(duì)照，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明，RA患者PBMC以糖酵解為主，尤其在活動(dòng)期更為明顯。這個(gè)結(jié)果與在RA患者滑膜細(xì)胞中觀察到的現(xiàn)象一致［1］。但是，Yang等［4］卻發(fā)現(xiàn)外周血CD4＋T細(xì)胞中這4個(gè)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)在健康人群與RA患者之間沒有顯著性差異，這個(gè)不一致的結(jié)果可能與病情嚴(yán)重程度有關(guān)。Yang等的研究中活動(dòng)期RA患者僅為80%，由此有可能導(dǎo)致了糖酵解相關(guān)基因變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的結(jié)果。同時(shí)除CD4＋T細(xì)胞外，PBMC中還含有大量的其他類型T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞等，他們?cè)诩せ顥l件下，均表現(xiàn)為糖酵解活性的增強(qiáng)［5－6］。如活化的CD8＋T細(xì)胞在大量增殖前，就表現(xiàn)為早期糖酵解關(guān)鍵酶3-磷酸甘油醛脫氫酶的活性升高［7］。同時(shí)活化后的B淋巴細(xì)胞也表現(xiàn)為可以快速地?cái)z取葡萄糖，并轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒跆墙徒獾拇x方式［8－9］。

在炎癥狀態(tài)下，大量活化的淋巴細(xì)胞通過(guò)高速率的糖酵解反應(yīng)產(chǎn)生ATP和蛋白質(zhì)合成代謝前體物質(zhì)，以維持自身的生長(zhǎng)、克隆擴(kuò)增和免疫球蛋白的合成［10－11］。本研究中TPI的升高有利于催化糖酵解和糖異生中重要反應(yīng)3-磷酸甘油醛生成更多的二羥丙酮磷酸，而二羥丙酮磷酸是合成三酰甘油的原料α-磷酸甘油的重要來(lái)源。2-磷酸甘油酸經(jīng)過(guò)ENO和PKM作用后產(chǎn)生丙酮酸，同時(shí)釋放2個(gè)ATP。丙酮酸又可通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用生成丙氨酸。糖酵解的快速升高伴隨著乳酸的大量生成，已發(fā)現(xiàn)活化的B細(xì)胞中80%的葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，而MCT的升高有利于大量的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。糖酵解的代謝方式還有利于改變活化的淋巴細(xì)胞中葡萄糖的碳流向磷酸戊糖途徑，以提供NADPH和5-磷酸核糖，或者改變糖酵解的終產(chǎn)物丙酮酸進(jìn)入截短的三羧酸循環(huán)，以產(chǎn)生乙酰CoA和草酰乙酸［12］。乙酰CoA作為脂肪酸和膽固醇合成的前體，可以促進(jìn)膜的生物合成［13］。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作為一種自身免疫細(xì)胞活化引發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)，其細(xì)胞活化與增殖需要大量的ATP，因此能量代謝方式會(huì)有其特征性的變化，如能明確這種變化與疾病進(jìn)程的關(guān)系，可為RA的早期診斷及臨床療效觀察提供新的指標(biāo)，同時(shí)也為RA的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路，并可為發(fā)展基于調(diào)節(jié)能量代謝的新型治療手段提供理論支持。

總之，本研究表明，活動(dòng)期RA患者PBMC糖酵解相關(guān)基因mRNA表達(dá)顯著提高，說(shuō)明糖酵解反應(yīng)在RA的發(fā)病過(guò)程中明顯增強(qiáng)。有關(guān)升高的糖酵解反應(yīng)在RA發(fā)病中的具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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Expression of glycolysis related gene in peripheral blood mononuclear cells of patients w ith rheumatoid arthritis

XIONG Yu-yun1，WANG Bei1，TAO Zhen1，WU Ling2，YOU Hai-yan1，WANGWen-hong3，JIAO Zhi-jun1
（1.Departmentof Clinical Laboratory，2.Departmentof Rheumatism，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；3.School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To explore themRNA expression and potential significance of glycolysis related gene in peripheral blood mononuclear cells（PBMC）of patientswith rheumatoid arthritis（RA）.M ethods：PBMC were purified by Ficoll and glycolysis related genes mRNA expression was analysed by real-time PCR.Results：Compared with healthy control，PBMC from active RA patients significantly expressed higher level of glycolysis related genes including TPI，ENO，PKM and MCT.However，there were no significant differences in these genes between inactive group and control group.Conclusion：In RA patients，glycolysis related genesmRNA expression levelwere changed.Glycolysismay play an important role in themechanism of RA.

rheumatoid arthritis；real-time PCR；glycolysis related gene；peripheral bloodmononuclear cell

R593.22

A

1671－7783（2014）04－0351－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140141

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81301657）；鎮(zhèn)江市衛(wèi)生科技重點(diǎn)項(xiàng)目（SH2011051）

熊御云（1983—），女，博士研究生；焦志軍（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：jiaozhijun＠ujs.edu.cn

2014－05－26 ［編輯］何承志