楊雙雙杜麗莎李豪男楊 青△

（1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生化系 上海 200433；2金日成綜合大學(xué)生命科學(xué)系 平壤）

吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）的色胺酮類抑制劑篩選及其體外抗腫瘤作用

楊雙雙1杜麗莎1李豪男2楊 青1△

（1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生化系 上海 200433；2金日成綜合大學(xué)生命科學(xué)系 平壤）

目的評(píng)價(jià)色胺酮衍生物吲哚胺2，3-雙加氧酶 （indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）的抑制活性，并研究其作為IDO抑制劑的抗腫瘤作用。方法采用基因工程手段表達(dá)、純化重組人IDO（rhIDO），建立IDO活性檢測(cè)體系；以色胺酮衍生物作為對(duì)象，進(jìn)行IDO抑制活性初篩，對(duì)抑制類型、半數(shù)抑制濃度以及抑制常數(shù)進(jìn)行測(cè)定；構(gòu)建高表達(dá)人IDO的pcDNA3.1（+）-hIDO轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，評(píng)價(jià)色胺酮衍生物在細(xì)胞水平上的IDO抑制活性；采用MTT比色法考察色胺酮衍生物3對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果6個(gè)被測(cè)色胺酮衍生物均具有IDO抑制活性，且細(xì)胞水平上的抑制效力高于酶活水平，抑制效力均優(yōu)于目前通用的IDO抑制劑1-甲基色氨酸（1-methyl-tryptophan，1-MT）。色胺酮衍生物3作為最強(qiáng)的IDO抑制劑，其Ki值為0.161μmol/L。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，色胺酮衍生物3顯著抑制 A549細(xì)胞生長(zhǎng)，IC50為8.77μmol/L。結(jié)論色胺酮衍生物是一類新型高效的IDO抑制劑，在體外對(duì)A549細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

活性檢測(cè)； 色胺酮衍生物； 吲哚胺2，3-雙加氧酶 （IDO）； 抗腫瘤作用

吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）是肝臟以外唯一催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑（kynurenine pathway，KP）代謝的限速酶[1]，已被證實(shí)與腫瘤、阿爾茨海默病、抑郁癥和老年性白內(nèi)障等多種人類重大疾病密切相關(guān)。而IDO的表達(dá)或活性的異常增高，是導(dǎo)致上述疾病的一個(gè)重要因素[2]，所以篩選高效的IDO抑制劑可以為這些疾病提供有效治療藥物。

自1967年IDO被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，至今未被商品化，這給IDO活性檢測(cè)系統(tǒng)的建立帶來(lái)了困難，所以國(guó)內(nèi)少有開展IDO抑制劑的化學(xué)合成與天然提取的相關(guān)工作。本研究采用基因工程手段獲得純化的rhIDO，以此建立了穩(wěn)定的IDO生物活性檢測(cè)系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)進(jìn)行IDO抑制劑的篩選工作。盡管IDO抑制劑的研究在國(guó)外已經(jīng)開展數(shù)十年，但是目前還沒(méi)有IDO抑制劑藥物問(wèn)世?，F(xiàn)有的IDO抑制劑普遍存在抑制效率低下、無(wú)法透過(guò)細(xì)胞膜以及產(chǎn)生吲哚環(huán)結(jié)構(gòu)代謝物質(zhì)等問(wèn)題[3]。20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的1-甲基色氨酸（1-methyl-tryptophan，1-MT）是目前體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中普遍使用的IDO抑制劑，其抑制常數(shù)（Ki）為34μmol/L[4]。

近年來(lái)，抑制IDO在腫瘤治療中的作用引起了眾多學(xué)者的關(guān)注[5-6]。研究證實(shí)IDO在多種實(shí)體腫瘤如肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，且與預(yù)后密切相關(guān)[7]。Friberg等[8]研究發(fā)現(xiàn)1-MT體外能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞免疫刺激的敏感性，體內(nèi)在Lewis肺癌小鼠模型中能夠延緩腫瘤的生長(zhǎng)。Muller等[9]發(fā)現(xiàn)在自發(fā)性乳腺癌 MMTVNeu小鼠模型中，1-MT與化療藥紫杉醇、順鉑、環(huán)磷酰胺和阿霉素合用，能引起腫瘤的消除。

因此，使用IDO抑制劑可能成為一種治療腫瘤的有效方法。本研究建立穩(wěn)定的IDO活性檢測(cè)體系，篩選新型高效的IDO抑制劑，并進(jìn)行IDO抑制劑抗腫瘤作用的初步研究。

材料和方法

藥品與試劑1-MT、L-犬尿氨酸、IPTG、MTT、DMSO （美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；L-色氨酸、亞甲基藍(lán)、過(guò)氧化氫酶、對(duì)二甲氨基苯甲醛（日本W(wǎng)ako公司）；HEK 293 細(xì)胞（ATCC CRL-1573）、DMEM 培養(yǎng)基、opti-MEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、Lipofectamin 2000、Hank＇s平衡鹽溶液（美國(guó)Gibco公司）；大腸埃希菌BL21、Top10（博大泰克公司）；Endofree Plasmid Kit（上海天根公司）。

儀器和設(shè)備電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），SCS-24恒溫?fù)u床（江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），722分光光度計(jì)（上海分析儀器總廠），倒置顯微鏡（CKX-41-32，日本 OLYMPUS公司），F(xiàn)orma series CO2培養(yǎng)箱、Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo scientific公司），SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

重組人IDO表達(dá)及純化經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的p ET28a-hIDO表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取單菌落于含50μg/m L卡那霉素的培養(yǎng)基中，37℃ 過(guò)夜培養(yǎng)；按1∶50將過(guò)夜培養(yǎng)物接種于含50μg/m L卡那霉素的LB中，當(dāng)D600=0.6時(shí)加入血紅素生物合成中間體α-氨基乙酰丙酸（ALA）同時(shí)將溫度降至30℃，最后加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，30℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。3968×g離心10 min收集菌體；用適量PBS（含1 mmol/L PMSF）重懸菌體，超聲破碎；4℃下3968×g離心10 min，取上清。將上清注入預(yù)先用含10 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L，p H 7.4）平衡的Ni柱上，用含40 mmol/L咪唑的PBS洗去雜蛋白后，用含250 mmol/L咪唑的PBS洗脫下rhIDO，Sephadex G25柱脫鹽，得到純化的rhIDO蛋白質(zhì)。

體外IDO活性檢測(cè)體系的建立IDO活性檢測(cè)體系在Littlejohn等[10]研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。在500μL反應(yīng)體系中，先將50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（p H 6.5）、40 mmol/L抗壞血酸、200μg/m L過(guò)氧化氫酶、20μmol/L亞甲基藍(lán)、底物L(fēng)-色氨酸和待測(cè)樣品混合，混合液37℃ 預(yù)熱5 min，再向上述混合液內(nèi)加入0.05μmol/L rhIDO酶，37℃反應(yīng)30 min，酶促反應(yīng)后加入30%（W/V）三氯乙酸200 μL使終止反應(yīng)，反應(yīng)液在65℃加熱15 min，使之完成從N-甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的轉(zhuǎn)化。然后13523×g離心10 min，取上清與等體積2% （W/V）對(duì)-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，使用酶標(biāo)儀在492 nm觀測(cè)犬尿氨酸與之反應(yīng)產(chǎn)生的黃顏色。以1-MT作為陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)建立的IDO活性檢測(cè)體系是否有效。

抑制類型及Ki、IC50值測(cè)定利用上述反應(yīng)體系，加入50μmol/L抑制劑和不同濃度的IDO酶，其他處理方法同上，最后以反應(yīng)速度對(duì)酶濃度作圖，根據(jù)所得曲線的關(guān)系判斷抑制劑類型。抑制常數(shù)Ki及IC50值的測(cè)定同樣利用上述反應(yīng)體系，加入不同濃度底物L(fēng)-色氨酸，在一個(gè)底物濃度下，加入不同濃度的抑制劑，其他處理方法同上，最后以Dixon作圖法得到Ki值[11]，利用改良寇氏法計(jì)算出IC50值。

細(xì)胞水平IDO抑制活性測(cè)定將 HEK 293細(xì)胞以2.5×104/孔的密度接種于96孔板中，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（含10% 胎牛血清、50 U/mL青霉素，50 mg/mL鏈霉素），置于37℃、濕度95%、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后使用脂質(zhì)體Lipofectamin 2000介導(dǎo)pcDNA3.1（+）-hIDO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后加入待測(cè)藥物，孵育5 h后，取140μL上清到另一96孔板中，加入10μL 30%（W/V）三氯乙酸，65℃加熱15 min，13523×g離心10 min，取等體積2%（W/V）對(duì)-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合顯色，最后采用酶標(biāo)儀在492 nm檢測(cè)吸光度（D）值。

MTT法測(cè)定色胺酮衍生物3對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板（細(xì)胞數(shù)為5×104/孔，100μL/孔），加入不同濃度的色胺酮衍生物3，使其終濃度分別為0、5、10、20、40、80μmol/L，最后用 DMEM 全培養(yǎng)基補(bǔ)充至每孔200μL，置于37℃、濕度95%、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后每孔加人20μL MTT溶液（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，37℃ 水平搖床振蕩10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（D）值。生長(zhǎng)抑制率=（1-D實(shí)驗(yàn)孔/D對(duì)照孔）×100%，并求IC50值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié) 果

體外IDO活性檢測(cè)體系的建立實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了純化rhIDO的活性，制作了酶反應(yīng)進(jìn)程曲線（圖1A）。通過(guò)繪制L-犬尿氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1B），得到吸光度與濃度關(guān)系曲線。從進(jìn)程曲線中可以看出純化所得rhIDO具有色氨酸催化活性。利用該體系，測(cè)得1-MT的IC50為328μmol/L，與文獻(xiàn)報(bào)道的380μmol/L相近[4]，并且可以重復(fù)。因此我們認(rèn)為IDO抑制劑的體外酶活篩選體系已經(jīng)成功建立，可用于IDO抑制劑的篩選。

IDO抑制劑的篩選利用上述體外IDO活性檢測(cè)體系對(duì)一系列色胺酮衍生物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)6個(gè)化合物均具有很強(qiáng)的IDO抑制活性，其中色胺酮衍生物3和4的IDO抑制效果比色胺酮顯著（圖2），6個(gè)化合物都是優(yōu)于1-MT的IDO抑制劑。

圖1 rhIDO酶反應(yīng)進(jìn)程曲線和L-犬尿氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 The curve of rhIDO enzyme reaction and the standard curve of L-kynurenineA：Curve of rhIDO enzyme reaction；B：Standard curve of L-kynurenine.

圖2 色胺酮衍生物的IDO抑制活性Fig 2 IDO inhihitory activity of tryptanthrin derivativesControl：No inhibitor.The concentrations of tryptanthrin derivatives and 1-MT were 100μmol/L.Results are expressed as±sfrom 3 independent experiments.

抑制類型判定及Ki、IC50的測(cè)定在固定抑制劑濃度的條件下，用一系列不同濃度的酶與抑制劑反應(yīng)并測(cè)定反應(yīng)速度。以反應(yīng)速度對(duì)酶濃度作圖[12]，根據(jù)曲線的特征可以判定6個(gè)色胺酮衍生物均為可逆抑制劑（圖3）。同時(shí)利用IDO活性檢測(cè)體系，測(cè)定抑制常數(shù)Ki及半數(shù)抑制濃度IC50（圖3，表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個(gè)化合物中3、4的Ki和IC50值已達(dá)到了納摩爾級(jí)別。

細(xì)胞水平IDO抑制活性利用質(zhì)粒pcDNA 3.1（+）-IDO轉(zhuǎn)染 HEK 293細(xì)胞，使其高表達(dá)IDO，然后測(cè)定5個(gè)色胺酮衍生物在細(xì)胞水平的IDO抑制活性。結(jié)果顯示色胺酮衍生物對(duì)細(xì)胞內(nèi)的IDO同樣具有抑制作用，并且抑制效果優(yōu)于體外酶活效果 （圖4）。

色胺酮衍生物3對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用體外酶活水平和細(xì)胞水平的IDO抑制結(jié)果表明，色胺酮衍生物3是一個(gè)具有很大潛力的IDO抑制劑（圖5）。MTT法進(jìn)一步研究其對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著色胺酮衍生物3的濃度增加，其對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)，半數(shù)抑制濃度IC50為8.77μmol/L，而1-MT即使在最高濃度80 μmol/L時(shí)也幾乎不能抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)。

表1 色胺酮衍生物的抑制常數(shù)Ki和IC50值Tah 1 The kinetic parameters and IC50values of tryptanthrin derivatives

圖3 色胺酮衍生物的抑制類型和Ki值的測(cè)定Fig 3 Determination of the inhihition types and kinetic parameters of tryptanthrin derivativesA：Plot of reaction rate[V]against enzyme amount[E].The concentrations of L-tryptophan and the inhibitor were 300μmol/L and 50 μmol/L，respectively.B：Determination of the kinetic parameters.Plot of[S]/[V]against the concentration of the inhibitor（[I]）.L-tryptophan concentration varied from 150μmol/L to 350μmol/L.The intersection point in the plot stands for measuring the apparent inhibition constant Ki.

圖4 色胺酮衍生物細(xì)胞水平的IDO抑制活性Fig 4 Cell-hased assay of IDO inhihition of tryptanthrin derivativesPercent inhibition against log[I]was plotted and IC50value was determined.

圖5 色胺酮衍生物3對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用Fig 5 Inhihitory effect of compound 3 on A549 cells

討 論

基于IDO在腫瘤免疫耐受的形成和維持中所發(fā)揮的重要作用，IDO已被證實(shí)是一個(gè)抑制惡性腫瘤形成和提高腫瘤免疫治療效果的新靶點(diǎn)[13]。IDO抑制劑作為相關(guān)治療的潛在藥物，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

目前已有的IDO抑制劑主要分為以下幾個(gè)類別：競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如色氨酸衍生物1-MT[4]；非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如苯基咪唑[14]；反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如生物堿exiguamine A[15]；通過(guò)其他作用機(jī)制的抑制劑。1-MT作為與底物色氨酸結(jié)構(gòu)最接近的抑制劑，已經(jīng)成為體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中普遍使用的IDO抑制劑。遺憾的是，雖然經(jīng)過(guò)多年的努力，目前只有2個(gè)IDO抑制劑進(jìn)入臨床研究[16-17]，世界上還沒(méi)有IDO抑制劑類藥物上市。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立穩(wěn)定的IDO活性檢測(cè)體系，篩選得到6個(gè)具有IDO抑制活性的色胺酮衍生物，其中色胺酮衍生物3的抑制效果最強(qiáng)，其抑制常數(shù)Ki值為0.161μmol/L，IC50值為0.534μmol/L，抑制活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于1-MT（Ki值34μmol/L，IC50值380 μmol/L）[4]，其他5個(gè)化合物的抑制效果也在很大程度上優(yōu)于1-MT。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，色胺酮衍生物對(duì)細(xì)胞水平IDO同樣具有抑制作用，且抑制效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于體外酶活水平，表明色胺酮衍生物能夠很好地穿過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞水平發(fā)揮IDO抑制作用。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)色胺酮衍生物3能夠?qū)θ朔切〖?xì)胞肺癌A549細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性，其半數(shù)抑制濃度為8.77μmol/L。

色胺酮作為一種喹唑啉酮生物堿，其具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性，但作為IDO抑制劑還是第一次被發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)，色胺酮的抗腫瘤作用受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注，研究者對(duì)多種人類腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)[18]，但體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)寥寥無(wú)幾，對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549的抗腫瘤作用研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)抑制類型的判定、Ki和IC50值的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)色胺酮衍生物是一類新型高效的IDO抑制劑，在體外對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步探索，通過(guò)使用色胺酮衍生物來(lái)控制IDO的活性，逆轉(zhuǎn)由IDO介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞免疫耐受，從而控制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，可能成為防治惡性腫瘤的有效方法，也可能成為色胺酮的一種新的抗腫瘤機(jī)制。

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Screening of tryptanthrin derivatives of indoleamine 2，3-dioxygenase（IDO）inhihitor and their antitumor activityin vitro

YANG Shuang-shuang1，DU Li-sha1，RI Ho-nam2，YANG Qing1△
（1Department of Biochemistry，School of Life Science，F(xiàn)udan University，Shanghai200433，China；2Department of Biochemistry，F(xiàn)aculty of Life Science，KimⅡSung University，Pyongyang，D.P.R.Korea）

activity assay； tryptanthrin derivatives； indoleamine 2，3-dioxygenase（IDO）；antitumor activity

Q 331

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.02.002

2013-03-13；編輯：王蔚）

國(guó)家自然科學(xué)基金（30873153）

△Corresponding author E-mail：yangqing68@fudan.edu.cn

【Ahstract】 OhJectiveTo evaluate the inhibitory activity of tryptanthrin derivatives of indoleamine 2，3-dioxygenase（IDO），and to explore the effects on human non-small cell lung cancer A549 cell growth.MethodsIDO activity assay system was established with recombinant human IDO （rhIDO），which was expressed and purified by the technology of genetic engineering.Based on the system，we detected the IDO inhibitory activity of tryptanthrin derivatives，and determined the inhibition type，kinetic parameters and IC50values.We also evaluated the IDO inhibitory effects of tryptanthrin derivatives on HEK 293 cells transfected with pcDNA3.1（+）-hIDO.Inhibitory activity of tryptanthrin derivatives on A549 cell growth inhibition was analysed by MTT assay.ResultsSix tryptanthrin derivatives displayed higher IDOinhibitory activity than 1-methyl tryptophan （1-MT），which is the commonly used IDO inhibitor.IC50values of tryptanthrin derivatives，obtained from the HEK 293 cell-based assay，were much lower than that from the enzyme assay.Compound 3 was the best inhibitor and had Ki value of 0.161μmol/L.Treating A549 cells with 3 remarkably inhibited the cell growth，and its IC50value was 8.77μmol/L.ConclusionsTryptanthrin derivatives are novel and potent IDOinhibitors，and can significantly inhibit human non-small cell lung cancerA549 cell growthin vitro.

*This work was supported hy the National Natural Science Foundation of China（30873153）.