孫 健， 于金鳳， 欒海榮， 李 爽， 許曉義， 何志鵬， 魏 韜， 李 麗， 徐長慶

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江，牡丹江 157011； 2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

鈣是人體內(nèi)最重要的元素之一，在生理狀態(tài)下，Ca2+通過鈣通道、交換體和泵等引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度([Ca2+]i)的變化而發(fā)揮作用，因此將Ca2+稱為“第二信使”。 隨著鈣敏感受體(calcium-sensing receptor, CaSR)的克隆，人們逐漸發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外Ca2+可以通過 CaSR發(fā)揮第一信使的作用[1]。CaSR是G蛋白偶聯(lián)受體超家族中C家族的一名成員，由Brown 等[2]于1993年首先在牛甲狀旁腺主細(xì)胞中成功克隆，在調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮決定性的作用，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡、基因表達(dá)、離子通道激活、激素分泌等。

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)是由著床前囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass, ICM)早期胚胎分離出來的全能干細(xì)胞，在體外可長期保持未分化狀態(tài)并無限增殖，且保持分化為全身各種細(xì)胞和組織的潛能[3]。ESCs是1981年由Evans等[4]首次從延遲植入小鼠囊胚中分離出來的多能性細(xì)胞，從此以后便引起各國學(xué)者的關(guān)注，是研究ESCs功能和調(diào)控的常用工具。目前關(guān)于CaSR在ESCs中的表達(dá)，對ESCs內(nèi)鈣和細(xì)胞的增殖是否有影響，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此，本文以小鼠ESCs (mouse ESCs,mESCs)為觀察對象，對上述尚未解決的問題開展如下的研究。

材 料 和 方 法

1 材料

129小鼠ES-D3細(xì)胞株(CRL-11632)購于美國菌種保藏中心；胎牛血清購自Gibco；小鼠白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)購自Chemicon；CaSR購自Alomone Labs； NPS2390、NiCl2、CdCl2、U73122、U73343、毒胡蘿卜素(thapsigargin,TG)和caffeine購自Sigma；Cycle TEST試劑盒(BDIS);Fluo-3/AM購自Invitrogen；FITC熒光標(biāo)記Ⅱ抗購自Sigma-Aldrich。

2 方法

2.1小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng) mESCs培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中，添加1%青-鏈霉素、1.7 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、1%非必需氨基酸和LIF(1×106U/L)、15%胎牛血清。細(xì)胞滴入在直徑35 mm或60 mm的培養(yǎng)皿，放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～3 d換液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次后，繼續(xù)無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2免疫熒光分析 mESCs用預(yù)冷0.1 mol/L PBS沖洗，4%多聚甲醛固定30 min，1%山羊血清封閉30 min；分別用抗CaSR(1∶100)孵育，4 ℃過夜，陰性對照用0.1 mol/L PBS代替Ⅰ抗；0.1 mol/L PBS沖洗3次；FITC標(biāo)記的IgG (1∶50)37 ℃孵育1 h；PBS沖洗3次，核用DAPI復(fù)染。立即在熒光顯微鏡(Leica)下觀察并照相。

2.3免疫印跡分析CaSR的表達(dá) mESCs隨機(jī)分為正常對照組，實(shí)驗(yàn)組分別用0.4 mmol/L 新霉素和10 μmol/L NPS2390作用24 h。RIPA緩沖液冰上裂解30 mim后，4 ℃離心(12 000 r/mim)15 mim，提取細(xì)胞總蛋白。取20 μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳，300 mA轉(zhuǎn)移2 h至硝酸纖維素膜，封閉液中封閉1 h。Ⅰ抗分別為anti-CaSR (1∶1 000)和anti-GAPDH (1∶500)，4 ℃過夜。同時(shí)，以CaSR抗原-抗體復(fù)合物代替Ⅰ抗，作為陰性對照。洗膜后，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗 IgG抗體(1∶1 000)孵育1 h。顯色液(Promega) 顯色, 吸光度掃描半定量分析顯影條帶。

2.4[Ca2+]i的測量 各組細(xì)胞棄培養(yǎng)液，用 [140 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1.8 mmol/L CaCl2，0.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L glucose，5.5 mmol/L HEPES(pH 7.4)[5]] 洗滌3次。Fluo-3/AM (5 μmol/L) 37 ℃恒溫箱中避光孵育40 min，去除負(fù)載液，含鈣Krebs溶液洗滌3次后，保存于含鈣Krebs溶液中備用。在鏡下選取細(xì)胞狀態(tài)好，質(zhì)膜完整，無顆粒的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。激發(fā)波長為488 nm。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖周期 分別取各組培養(yǎng)的mESCs，經(jīng)0.25%胰蛋白酶-0.02 EDTA消化后，PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L，制成單細(xì)胞懸液，2 000 r/min離心 5 min，PBS洗滌1次，2 000 r/min離心 5 min，加3 mL預(yù)冷的乙醇固定，4 ℃過夜，200 r/min離心 5 min，加入緩沖液3 mL洗滌1次，2 000 r/min離心 5 min，加A液250 μL，室溫作用10 min，加B液200 μL，室溫作用10 min，加預(yù)冷的C液200 μL，室溫避光10 min，上機(jī)檢測。

2.6MTT比色法分析細(xì)胞存活率的變化 96孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后(每組重復(fù)12孔)，每孔加入MTT溶液20 μL(5 g/L), 37 ℃繼續(xù)孵育 4 h, 棄上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜 (DMSO)，振蕩10 min 使結(jié)晶物完全溶解。選擇490 nm波長，自動(dòng)酶聯(lián)儀檢測各孔吸光度A值 (A490)，反復(fù)3次取平均值。每孔A值減去空白孔A值為測試孔A真值，活細(xì)胞數(shù)與A490成正比。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。各組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

根據(jù)礦體圍巖及鐵礦中的硫同位素δ34S值均介于-9.7～+2.2之間[11]，具未分異的隕石流的特點(diǎn)，說明這些物質(zhì)都來看自地幔。

結(jié) 果

1 mESCs的形態(tài)特征

倒置顯微鏡下觀察，mESCs在條索狀小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層(feeder layer，F(xiàn)L)上的形態(tài)特征為細(xì)胞圓形或橢圓形，呈集落生長，邊緣清晰、光滑，其所形成的生長集落和飼養(yǎng)層有明顯的界限,見圖1A。在脫離飼養(yǎng)層，生長在明膠上時(shí)，mESCs首先由集落樣生長逐漸過渡到單層生長,見圖1B。mESCs增殖旺盛，一般2～3 d傳代。

Figure 1. Morphology of the mouse embryonic stem cells (×200). A: embryonic stem cells on feeder layer (↑); B: embryonic stem cells on gelatin (↑).

2 CaSR在mESCs的表達(dá)

2.1免疫熒光檢測CaSR在mESCs的表達(dá) 在mESCs的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中可見特異性綠色熒光,見圖2B，DAPI將核染為藍(lán)色；無CaSR 抗體組僅見核藍(lán)染,見圖2A。這說明CaSR在mESCs的胞膜與胞漿均有表達(dá)。

Figure 2. Detection of CaSR expression in mESCs by immuno-fluorescence with FITC-conjugated IgG in the absence (A) or presence (B) of the primary antibody against CaSR (×200).

2.2Western blotting檢測CaSR在mESCs的表達(dá) 結(jié)果顯示,在160 kD檢測出特異性蛋白條帶，陰性對照組未見任何條帶出現(xiàn)；給予0.4 mmol/L neomycin(鈣敏感受體激動(dòng)劑)后CaSR蛋白表達(dá)明顯增多(與對照組相比，P<0.05)；用0.01 mmol/L NPS2390(CaSR 抑制劑)處理后這種效應(yīng)被抑制(與激動(dòng)劑組比較，P<0.05)，見圖3。

3 不同處理因素對mESCs[Ca2+]i變化的影響

3.1Neomycin、NPS2390、CdCl2和NiCl2對mESCs內(nèi)鈣濃度的影響 1.8～5.8 mmol/L的細(xì)胞外鈣可以引起細(xì)胞內(nèi)鈣的增加(我們選用5.8 mmol/L的CaCl2進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn))。0.1～0.4mmol/Lneomycin可呈濃度依賴性地引起細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，0.4 mmol/L時(shí)達(dá)到平臺期，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度不再增加(我們選用0.4 mmol/L的neomycin進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn))。NiCl2(0.5 mmol/L)和L-型鈣通道阻斷劑CdCl2(0.01 mmol/L)預(yù)先孵育0.5 h可以明顯抑制CaCl2引起的細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，應(yīng)用0.5 mmol/L NiCl2、0.01 mmol/L CdCl2和0.01 mmol/L NPS2390預(yù)先孵育0.5 h可以完全消除CaCl2引起的細(xì)胞內(nèi)鈣增加,見圖4、5。同時(shí)，0.01 mmol/L NPS2390預(yù)先孵育0.5 h可以完全消除neomycin引起的細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。

Figure 3. The effects of neomycin and NPS2390 on CaSR expression in mESCs.Mean±SD.n=4. *P< 0.05 vs control group; #P<0.05 vs neomycin group.

Figure 4. Effects of different concentrations of CaCl2 (A) or neomycin (B) on [Ca2+]i in mESCs.Mean±SD.n=6.

3.2細(xì)胞外鈣或neomycin誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣增加的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 TG(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫的阻斷劑，10 μmol/L)、U73122(PLC的阻斷劑，10 μmol/L)、咖啡因(肌漿網(wǎng)鈣庫耗竭劑，10 μmol/L)或者2-APB(IP3的阻斷劑，10 μmol/L)預(yù)處理后都可以減弱甚至消除5.8 mmol/L CaCl2或0.4 mmol/L neomycin所引起的細(xì)胞內(nèi)鈣的增加 (與control比較,P>0.05)，而U73343(U73122無活性的同型體，10 μmol/L)預(yù)處理后對這種細(xì)胞內(nèi)鈣的增加沒有影響,見圖5。這些結(jié)果提示,CaSR的活化引起細(xì)胞內(nèi)鈣增加是通過G蛋白-PLC-IP3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。

Figure 5. The effects of different agents on the increase in [Ca2+]i induced by extracellular Ca2+ or neomycin in mESCs. A: the cells in the experimental groups were pretreated with NiCl2 and CdCl2 in the absence or presence of NPS2390, U73122, U73343, caffeine, 2-aminoethyldiphenyl broate (2-APB) or thapsigargin (TG) for 30 min, then exposed consecutively to CaCl2; B: the cells in experimental groups were exposed to neomycin with or without pre-treatment with NPS2390, U73122, U73343, coffeine, 2-APB or TG for 30 min.

4 CaSR活化對胚胎干細(xì)胞增殖的影響

4.1MTT分析胚胎干細(xì)胞的存活率 我們首先觀察了不同濃度新霉素對mESCs細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，0.4 mmol/L 新霉素對細(xì)胞的增殖影響最為顯著,見圖6，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用0.4 mmol/L 新霉素。以正常對照組細(xì)胞的存活率為 100% 計(jì)算，新霉素組存活率為149%±7%，明顯高于正常組(P<0.05)；新霉素+NPS2390 組mESCs存活率為97%±9%，明顯低于新霉素組(P<0.05)；ERK的特異性抑制劑PD98059的增殖率為109%±8%(和對照組比,P>0.05),見圖7。

Figure 6. The effects of different concentrations of neomycin on proliferation of mESCs.Mean±SD.n=6. *P<0.05,**P<0.01 vs control group.

Figure 7. Cell viability determined by MTT assay in mESCs.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group; ##P<0.01 vs neomycin group.

4.2細(xì)胞周期分析檢測胚胎干細(xì)胞的增殖指數(shù) 流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果顯示(圖8)，新霉素組與正常對照組相比，G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S和G2/M期細(xì)胞比例均顯著增加。細(xì)胞增殖指數(shù) (proliferation index,PI)=(S+G2/M)/ (S+G2/M+G0/G1) ，結(jié)果顯示，新霉素能顯著增加細(xì)胞S期比例和PI，約為正常對照組的1.16倍(P<0.05)；而新霉素+NPS2390可抑制胚胎干細(xì)胞增殖，PI回落至約為1；PD98059的作用和NPS2390類似。

Figure 8. Detection of proliferation index by analysis of cell cycle.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs neomycin group.

4.3Western blotting檢測各組mESCs中CaSR和p-ERK2/t-ERK的蛋白水平 mESCs表達(dá)p-ERK2蛋白，其分子量為44 kD。與正常組相比，新霉素組細(xì)胞CaSR(圖9)和p-ERK2蛋白(圖10)表達(dá)增加(P<0.05)；與激動(dòng)劑組相比，NPS2390(CaSR抑制劑)組CaSR和p-ERK2蛋白表達(dá)均減少(P<0.05)；ERK 的特異性抑制劑PD98059對CaSR蛋白表達(dá)增加則沒有顯著影響(和對照組相比，P>0.05)，p-ERK2蛋白表達(dá)與對照組相比有所減少，但不明顯(P>0.05)。

Figure 9. Protein expression of CaSR in the mESCs with different treatments determined by Western blotting.Mean±SD.n=4. △P<0.05 vs control group;**P<0.01 vs neomycin group.

Figure 10. The protein expression of p-ERK2 in the mESCs with different treatments determined by Western blotting. Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs control group;△P<0.05 vs neomycin group.

討 論

最近研究表明CaSR在某些干細(xì)胞也有表達(dá)，Lam等[6]發(fā)現(xiàn)在體外CaSR激活能增強(qiáng)原始造血干細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)歸巢。Xu等[7]發(fā)現(xiàn)CaSR活化促進(jìn)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖作用是由于增加增殖指數(shù)，減少細(xì)胞凋亡，且能夠增加p-ERK1/2的蛋白表達(dá)。CaSR與mESCs增殖的關(guān)系至今國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

我們在mESCs的蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)中, 用抗CaSR的特異性抗體檢測出分子量為160 kD的條帶， 而陰性對照組未出現(xiàn)任何條帶。這與Xu等[7]在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)一致，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)CaSR的激動(dòng)劑新霉素可以使CaSR蛋白的表達(dá)明顯增加，而且這種增加可以被CaSR抑制劑NPS2390所取消，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

免疫熒光結(jié)果顯示，CaSR蛋白存在于小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)，主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，該結(jié)果與在其它類型細(xì)胞中CaSR定位的報(bào)道一致[8-9]?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為在小鼠胚胎干細(xì)胞有CaSR蛋白的表達(dá)。

CaSR如同應(yīng)答多種細(xì)胞刺激的整合器，對[Ca2+]o微小波動(dòng)及其它陽離子均可發(fā)生反應(yīng)[9]。Ca2+、Gd3+、Mg2+、新霉素和精胺等都是CaSR的激動(dòng)劑。為了證實(shí)[Ca2+]o增加引起[Ca2+]i的增加是否與CaSR的激活有關(guān)，我們測定了mESCs中[Ca2+]i的變化,發(fā)現(xiàn)4 mmol/L CaCl2和0.4 mmol/L新霉素(CaSR激動(dòng)劑)都可以引起[Ca2+]i升高。NiCl2(Na+-Ca2+交換抑制劑)和CdCl2(L-型鈣通道阻滯劑)預(yù)處理后，[Ca2+]i的熒光強(qiáng)度降低，但仍比對照組高。而NiCl2+CdCl2+NPS2390(CaSR抑制劑)同時(shí)存在時(shí)，[Ca2+]i的熒光強(qiáng)度明顯降低，與對照組無顯著差異。這些結(jié)果提示，CaSR和L型鈣通道及Na+-Ca2+交換蛋白一起，共同參與了[Ca2+]o增加導(dǎo)致mESCs [Ca2+]i增加這一過程。

在ESCs存在2個(gè)功能不同的鈣離子釋放通道，即1,4,5 -三磷酸肌醇受體(IP3R)和ryanodine受體(RyR)已經(jīng)確定?？Х纫?coffeine)是細(xì)胞內(nèi)鈣庫耗竭劑(可促進(jìn)RyR受體開放)，而TG是肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶的阻斷劑。本研究發(fā)現(xiàn)，用TG和coffeine預(yù)處理30 mim，能顯著抑制4 mmol/L CaCl2和0.4 mmol/L新霉素誘導(dǎo)的[Ca2+]i的升高。這表明CaSR激活誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加主要源于細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+。

Wang等[10]證實(shí)，[Ca2+]o增加、Gd3+及精胺引起大鼠心肌細(xì)胞[Ca2+]i增加是通過G-PLC-IP3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：U73122(PLC抑制劑)和2-APB(IP3R抑制劑)均可以顯著地減弱Ca2+及新霉素誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加，而U73122的失活類似物U73343則無顯著作用。這些結(jié)果提示，在mESCs由CaSR活化誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加也可通過G蛋白-PLC-IP3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。

CaSR可以調(diào)節(jié)很多細(xì)胞內(nèi)信號途徑，包括磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、MAPK信號通路等，參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化。MAPK途徑包括p38、JNK和ERK，調(diào)控多種細(xì)胞功能，特別是在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡中起著關(guān)鍵的作用，其中ERK參與了MAPK超家族中對細(xì)胞生長和凋亡的調(diào)控[11]。本實(shí)驗(yàn)通過MTT法和流式細(xì)胞術(shù)2種方法觀察了CaSR的活化對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鈣敏感受體激動(dòng)劑新霉素使細(xì)胞存活率增加，而NPS2390減弱這種作用。ERK的特異性抑制劑PD98059對細(xì)胞的更新并沒有太大的影響。我們通過Western blotting檢測mESCs中CaSR和p-ERK2蛋白的表達(dá)，新霉素處理后二者表達(dá)皆增加，NPS2390則可減弱這種作用，PD98059組和正常對照組相比，對p-ERK2蛋白的表達(dá)沒有明顯影響，這可能還與上游信號通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。這些結(jié)果提示CaSR激活對mESCs的增殖具有一定的促進(jìn)作用，這與其它研究結(jié)果類似[7, 11-13]，但具體信號通路有待進(jìn)一步的研究。

總之，我們的研究首次證明了CaSR在mESCs存在表達(dá)。CaSR活化引起細(xì)胞內(nèi)鈣增加是通過G-PLC-IP3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的；CaSR活化能夠促進(jìn)mESCs的增殖，具體作用機(jī)制和信號途徑有待于進(jìn)一步研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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