華 蓮，郝桂明，唐素芳

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

藥品質(zhì)量與檢驗

HPLC法測定齊多夫定及其注射液的含量及有關(guān)物質(zhì)*

華 蓮，郝桂明，唐素芳

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

目的：建立HPLC梯度洗脫法測定齊多夫定及其注射液的含量及有關(guān)物質(zhì)。方法：采用島津Shim-pack CLC-ODS色譜柱(150 mm×6.0 mm，5 μm)，流動相A為甲醇，流動相B為水，按照時間程序進行梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測波長為215 nm，柱溫為40 ℃。結(jié)果：雜質(zhì)A和雜質(zhì)C在0.2～50.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)均與其峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9),雜質(zhì)A平均回收率為99.3%，RSD為1.4%(n=9)；雜質(zhì)C平均回收率為98.2%，RSD為1.9%(n=9)；雜質(zhì)B在0.4～50.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9),平均回收率為95.8%，RSD為1.0%(n=9)；雜質(zhì)D在0.2～25.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 8),平均回收率為106.8%，RSD為0.8%(n=9)；齊多夫定在0.4～50.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)。結(jié)論：該方法在一個色譜系統(tǒng)中同時檢出雜質(zhì)A、B、C、D，重復(fù)性好，結(jié)果準確，可用于齊多夫定及其注射液的含量及有關(guān)物質(zhì)測定。

齊多夫定，注射液，雜質(zhì)，質(zhì)量控制，標準提高，高效液相色譜法

齊多夫定最先于1964年合成，由英國GLaxo WeLLcome公司開發(fā)上市(商品名為“立妥威”)，1987年3月19日獲得美國FDA批準，是世界上第一個獲得美國FDA批準生產(chǎn)的抗艾滋病藥品，因其療效確切，成為“雞尾酒”療法最基本的組合成分。目前已有近百個國家用于臨床，仍是許多發(fā)展中國家治療艾滋病的首選藥之一。

齊多夫定的國內(nèi)合成路線大致相同，以β-胸苷或2,3’-脫水-5’-O-(三苯甲基)胸苷為起始原料，經(jīng)取代反應(yīng)、氧橋反應(yīng)、疊氮化反應(yīng)、脫保護反應(yīng)，粗品精制等步驟制備。原料藥中潛在的有機雜質(zhì)主要有雜質(zhì)A(司他夫定)、雜質(zhì)B(3’-氯-3’-脫氧胸苷)、雜質(zhì)C(胸腺嘧啶)、雜質(zhì)D(三苯基甲醇)、其他副產(chǎn)物等。目前，除《國家食品藥品監(jiān)督管理局標準》(YBH08572008、YBH21522004、YBH04342010)外，齊多夫定在《美國藥典》35版、《英國藥典》2012版、《國際藥典》2011版和《日本藥局方》第十六改正版均有收載。國內(nèi)外各標準大多采用TLC與HPLC兩個方法控制齊多夫定的雜質(zhì)。本文采用HPLC法進行梯度洗脫同時檢查齊多夫定及注射液中的所有雜質(zhì)。

1 儀器與試藥

AgiLent TechnoLogies 1260 Infinity高效液相色譜儀，AgiLent TechnoLogies 1290 Infinity紫外檢測器。雜質(zhì)A(司他夫定)對照品(USP REFERENCE STANDARD，USP ROCKVILLE提供，批號FOE050，含量為99.7%)；雜質(zhì)B(3’-氯-3’-脫氧胸苷)對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號101224-201101，含量為98.0%)；雜質(zhì)C(胸腺嘧啶)對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號140708-200401)；雜質(zhì)D(三苯甲醇)對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號101225-201101，含量為99.7%)；齊多夫定對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號100672-200401)；甲醇為色譜純(天津市康科德科技有限公司)；水為純化水；齊多夫定3批(1#～3#，批號AT00N120801、AT00N120802、AT00N120803，A公司提供)；齊多夫定注射液3批(4#～6#，批號20120201、20120202、20120203，B公司提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 采用島津Shim-pack CLC-ODS (150 mm× 6.0 mm，5 μm) 色譜柱；流動相A:甲醇；流動相B：水，梯度洗脫程序見表1，流速1.0 ml/min；檢測波長為215 nm；柱溫為40 ℃；進樣量10 μl。齊多夫定色譜峰的保留時間約為15 min，齊多夫定峰與雜質(zhì)B峰的分離度為3.4，能達到完全分離。

表1 齊多夫定梯度洗脫系統(tǒng)

2.2溶液制備

2.2.1含量測定供試品溶液 取1#供試品約10 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2含量測定對照品溶液 取齊多夫定對照品適量，同法操作。

2.2.3有關(guān)物質(zhì)供試品溶液 取1#供試品約10 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(齊多夫定注射液精密量取適量同法制備)。

2.2.4有關(guān)物質(zhì)對照品溶液 精密稱取雜質(zhì)A、雜質(zhì)D對照品12.5 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)對照品溶液①；精密稱取雜質(zhì)B、雜質(zhì)C對照品各10 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)對照品溶液②；分別精密量取雜質(zhì)對照品溶液①、②各1 ml，置100 ml量瓶中，精密加入供試品溶液1 ml，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.3專屬性試驗 取齊多夫定約10 mg共5份，分別置10 ml量瓶中，加甲醇適量振搖使溶解，在①、②、③3個量瓶中分別加1 mol/L的鹽酸溶液2 ml，1 mol/L的氫氧化鈉溶液2 ml，30%過氧化氫溶液2 ml，置 60 ℃水浴加熱1 h，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為酸破壞、堿破壞和氧化破壞溶液；將④量瓶置100 ℃水浴中放置3 h，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為高溫破壞溶液；將⑤量瓶加甲醇稀釋至刻度，搖勻，置日光下照射72 h后，作為光照破壞溶液。分別取上述溶液，按色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖1。

試驗表明，齊多夫定在酸、堿、高溫條件下雜質(zhì)均有所增加，在氧化條件下出現(xiàn)一明顯未知雜質(zhì)峰，在光照條件下，雜質(zhì)C增加較明顯。在該色譜條件下，齊多夫定峰與雜質(zhì)B峰的分離度達到3.4，表明該方法的專屬性良好，能使供試品中的雜質(zhì)完全分離并且定量檢出。

2.4線性關(guān)系考查 精密稱取齊多夫定對照品及雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C和雜質(zhì)D對照品各10 mg，置同一200 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液，精密量取適量，加甲醇稀釋制成濃度為0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0和50.0 μg/ml的系列溶液，分別精密量取上述溶液10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；以濃度為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸。齊多夫定與各雜質(zhì)的濃度范圍與線性方程見表2。

表2 齊多夫定與各雜質(zhì)的線性范圍與回歸方程

2.5精密度試驗 精密吸取“2.2.4”項下對照溶液10 μl，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，測定各峰面積。結(jié)果雜質(zhì)A、B、C、D及齊多夫定峰面積的RSD分別為0.42%、0.41%、0.35%、1.0%和0.42%。

1.雜質(zhì)C 2.雜質(zhì)A 3.齊多夫定 4.雜質(zhì)B 5.雜質(zhì)D

2.6溶液穩(wěn)定性試驗 將“2.2.3” 項下的供試品溶液分別在室溫放置4、8、12、24和48 h后依法進樣10 μl測定，觀察主峰及各雜質(zhì)峰面積的變化，主峰面積RSD為1.5%。試驗結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗 取1#供試品6份，按“2.9.2”項下方法重復(fù)測定，雜質(zhì)A的RSD為0(均為0.05%)，雜質(zhì)B的RSD為0(均未檢出)，雜質(zhì)C的RSD為6.8%，雜質(zhì)D的RSD為9.5%，雜質(zhì)總量的RSD為7.6%。

2.8回收率試驗 精密稱取1#供試品0.5 g置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品貯備液；精密稱取雜質(zhì)A、D對照品各10 mg，置200 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)對照品貯備液①，精密稱取雜質(zhì)B、C對照品各10 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)對照品貯備液②。精密量取供試品貯備液5 ml置50 ml量瓶中(共9份)，分別精密加入雜質(zhì)對照品貯備液①、②各4、5和6 ml(各3份)，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。雜質(zhì)A、B、C、D的平均回收率，結(jié)果見表3。

表3 平均回收率測定結(jié)果(n=9)

2.9供試品的測定

2.9.1含量測定 精密量取“2.2”項下供試品溶液與對照溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，按外標法以峰面積計算，即得。按上述方法對6批樣品進行含量測定，結(jié)果見表4。

表4 含量測定結(jié)果

2.9.2有關(guān)物質(zhì) 精密量取“2.2.4”項下對照溶液稀釋25倍，按上述色譜條件測定，齊多夫定色譜峰信噪比為10，作為靈敏度測試溶液(0.04%)。再精密量取“2.2”項下供試品溶液與對照溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時間的2.5倍。按上述方法測定6批樣品，同時按現(xiàn)行標準有關(guān)物質(zhì)項下方法測定，結(jié)果見表5。

表5 有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

注：-未檢出， * TLC法(無法定量)

3 討論

3.1檢測波長的選擇 按對照溶液的濃度分別制備雜質(zhì)A、B、C、D及齊多夫定溶液，在190～400 nm波長范圍內(nèi)測定最大吸收波長。雜質(zhì)A、B、C及齊多夫定均在266 nm波長處有最大吸收，但是雜質(zhì)D在該波長處吸收極小，在194 nm處有最大吸收，在低波長處響應(yīng)值較大(215 nm處為0.3以上)。雜質(zhì)A、B、C及齊多夫定在215 nm波長處的吸光度與266 nm處無明顯差別，同時考慮到流動相組分中有甲醇，故選擇215 nm為本系統(tǒng)的檢測波長。

3.2檢測結(jié)果的比較 目前國內(nèi)外各標準均采用TLC與HPLC兩個方法控制齊多夫定的雜質(zhì)。在TLC法中，雜質(zhì)B與齊多夫定Rf值相同，不能檢出雜質(zhì)B，主要檢查雜質(zhì)A與雜質(zhì)D，無法對雜質(zhì)進行準確定量，對其他雜質(zhì)也無法準確定量；采用HPLC法檢查雜質(zhì)B、雜質(zhì)C。而用本法測定，在一個色譜系統(tǒng)中將所有雜質(zhì)全部檢出及準確定量，能更準確地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

HPLCdeterminationofcontentandrelatedsubstancesinzidovudineandinjection

Hua Lian,Hao Guiming,Tang Sufang

(Tianjin Institute for Drug Control, Tianjin 300070)

Objective： To establish a HPLC gradient elutioned method for evaluating the content and the related substances of zidovudine and injection. Methods： Used Shim-pack CLC-ODS column (150 mm×4.6 mm，5 μm) ,and the mobile phaseA was methanol, mobile phaseB was water, gradient elutioned，the flow rate was 1.0 ml/min with column temperature at 40 ℃.The detection wavelength was 215 nm. Results：The assay displayed a good linearity of impurity A and C over the concentration range of 0.2～50.0 μg/ml(r=0.999 9)，the average recoveries were 99.3%(RSD was 1.4%,n=9)and 98.2%(RSD was 1.9% ,n=9).A good linearity of impurity B over the concentration range of 0.4～50.0 μg/ml(r=0.999 9)，the average recoveries were 95.8% (RSD was 1.0%,n=9).A good linearity of impurity D over the concentration range of 0.2～25.0 μg/ml(r=0.999 8)，the average recoveries was 106.8%(RSD was 0.8%,n=9).A good linearity of zidovudine over the concentration range of 0.4～50.0 μg/ml(r=0.999 9).Conclusion： The method is simple, accurate and can be used to the determination of the content and impurity A、B、C and D in the same chromatographic system.

zidovudine, injection,impurity，quality control,standard improvement,HPLC

2014-03-04

2012年全球基金項目國家藥品標準提高品種(No.GF2012-08/09)

R927.2

A

1006-5687(2014)04-0001-04