史煉鋼，馬馳，王東

論著·臨床

胃腸道間質(zhì)瘤分子靶向治療繼發(fā)性耐藥基因突變的研究

史煉鋼，馬馳，王東

目的探討胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)患者酪氨酸激酶受體(KIT)和血小板源性生長(zhǎng)受體(PDGFRA)基因突變的特點(diǎn)，以及伊馬替尼的繼發(fā)耐藥機(jī)制。方法對(duì)98例GIST患者腫瘤組織進(jìn)行DNA抽提、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增和直接測(cè)序，檢測(cè)KIT基因外顯子9、11、13、17和PDGFRA基因12、18外顯子突變；并對(duì)伊馬替尼繼發(fā)耐藥的65例患者進(jìn)行2次檢測(cè)。結(jié)果98例患者中，KIT突變79例 (80．6%)，其中外顯子11突變61例(62.2%)，外顯子9突變18例(18.4%)；PDGFRA突變3例(3.1%)。不同性別、年齡以及晚期GIST患者和潛在惡性的GIST患者間突變比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而不同部位GIST的KIT外顯子11突變發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。65例繼發(fā)耐藥病例中，4例患者發(fā)生二次突變,表現(xiàn)為KIT基因第17外顯子密碼子第2467位點(diǎn)的T為G所替換(T2467G),導(dǎo)致823密碼子編碼氨基酸由酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?。結(jié)論KIT基因突變?cè)贕IST患者中常見，不同部位間KIT外顯子11突變發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。伊馬替尼繼發(fā)耐藥可能與KIT基因第17外顯子密碼子第2467位點(diǎn)T為G所替換(T2467G)相關(guān)。

胃腸道間質(zhì)瘤；伊馬替尼；基因突變；耐藥性

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumors,GIST)起源于Cajal間質(zhì)細(xì)胞,是消化道最常見的間葉源性腫瘤,可發(fā)生在全消化道,其中以胃和小腸最多見,95%的GIST患者KIT基因(CD117)呈陽性表達(dá)。對(duì)于病變局限、可手術(shù)切除的GIST,外科手術(shù)是治療首選,但是許多患者術(shù)后仍然面臨腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[1～3]。伊馬替尼是一種選擇性酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)，通過阻斷酪氨酸激酶受體的功能來抑制GIST細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。伊馬替尼的出現(xiàn)為GIST的靶向治療帶來革命性的改變,極大地降低了GIST復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn),從而有效地改善了患者預(yù)后[4]。

然而部分GIST患者對(duì)伊馬替尼存在耐藥現(xiàn)象，可分為原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥，其中40%～50%的GIST患者在用藥2年內(nèi)會(huì)發(fā)生繼發(fā)耐藥[5，6]。Balachandran等[7]研究顯示，11%的患者對(duì)伊馬替尼產(chǎn)生原發(fā)性耐藥，絕大多數(shù)患者服用伊馬替尼后會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥。約23%的野生型kit/PDGFRA、16 % c-kit第9外顯子突變和c-kit第11外顯子突變發(fā)生原發(fā)性耐藥。約67%的繼發(fā)性耐藥是由c-kit第13 外顯子或第17 外顯子發(fā)生了繼發(fā)性突變所致[8]。因此，從基因水平探討耐藥機(jī)制可以指導(dǎo)治療方案的制定，對(duì)出現(xiàn)耐藥性患者及時(shí)調(diào)整治療方案，選擇合適的藥物治療。本文對(duì)98例GIST患者進(jìn)行了突變檢測(cè)，同時(shí)針對(duì)靶向藥物伊馬替尼治療耐藥的部分病例進(jìn)行了耐藥病灶的檢測(cè)，以了解耐藥與基因突變的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2008年9月—2012年9月接受伊馬替尼治療的GIST患者98例，均經(jīng)病理切片證實(shí)。其中男58例，女40例，年齡23～90歲。記錄詳細(xì)的服藥信息, 并進(jìn)行隨訪。其中對(duì)伊馬替尼耐藥的65例晚期GIST患者接受了手術(shù)切除或?qū)δ退幉≡畲┐袒顧z而取得組織進(jìn)行二次檢測(cè), 留取手術(shù)標(biāo)本。所有標(biāo)本行病理學(xué)檢查及KIT和PDGFRA基因測(cè)序。

1.2 免疫組織化學(xué) 患者標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定石蠟包埋,以免疫組織化學(xué)抗體進(jìn)行標(biāo)記以進(jìn)一步診斷: CD117 (A4502，多抗1∶200)購自Dako公司。CD117抗體用EnVision兩步法檢測(cè)。CD117以腫瘤細(xì)胞胞膜呈棕黃色為陽性,以黏膜內(nèi)的肥大細(xì)胞作為陽性內(nèi)對(duì)照。

1.3 惡性危險(xiǎn)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)參考文獻(xiàn)[9]分級(jí)，即腫瘤直徑<2 cm和核分裂相<5/50HPF為極低度侵襲危險(xiǎn)性；腫瘤直徑2～5cm和核分裂相<5/50HPF為低度侵襲危險(xiǎn)性；腫瘤直徑5～10cm和核分裂相<5/50HPF或腫瘤直徑<5cm和核分裂相6～10/50HPF為中度侵襲危險(xiǎn)性；腫瘤直徑>5cm和核分裂相>5/50HPF或腫瘤直徑>10cm或核分裂相>10/50HPF為高度侵襲危險(xiǎn)性。

1.4 KIT和PDGFRA基因序列分析 采用標(biāo)準(zhǔn)的酚—氯仿法從保存于-70e液氮中的冰凍腫瘤組織或石蠟包埋組織中提取DNA。將提取獲得的1 μg左右的基因組DNA用于PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用2%的MetaPhor瓊脂糖凝膠(BioWhittaker公司產(chǎn)品)電泳進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)文獻(xiàn)[7～9]的方法，應(yīng)用基因內(nèi)引物將KIT基因第9、11、13和17外顯子以及PDGFRA基因第12和18外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增。KIT基因擴(kuò)增引物見表1。應(yīng)用MicroSpin column (Amersham公司產(chǎn)品)純化PCR產(chǎn)物。采用BigDyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystems公司產(chǎn)品)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。使用3 mol/L的醋酸鈉將循環(huán)測(cè)序產(chǎn)物沉淀出來, 然后應(yīng)用ABI PRISM3730毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(Applied Biosystems公司產(chǎn)品)對(duì)整個(gè)外顯子和相應(yīng)的外顯子內(nèi)含子交界區(qū)進(jìn)行雙向DNA測(cè)序[10]。

表1 KTT/PDGFRα基因PCR擴(kuò)增引物序列

注：F.正向序列；R.反向序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GIST患者臨床資料及腫瘤特點(diǎn) 98例GIST中男58例，女40例,男∶女=1.45∶1，發(fā)病的中位年齡為55歲(23～90)歲,年齡分布：40～60歲 12例(12.2%),<40歲 19例(19.4%),≥60歲 67例(68.4%)。8例GIST是在食管癌或直腸癌手術(shù)時(shí)被偶然發(fā)現(xiàn)。腫瘤位于胃部31例 (31.6%)，空回腸50例 (51.0%)，十二指腸9例 (9.2%)，直腸6例(6.1%)，食管2例(2.0%)。經(jīng)檢測(cè)所有標(biāo)本CD117均為陽性。倒置顯微鏡下觀察，62例(63.3%)為梭形細(xì)胞型, 17例(17.3%)為上皮細(xì)胞型, 19例(19.4%)為混合細(xì)胞型。根據(jù)惡性危險(xiǎn)度分級(jí)：極低度侵襲危險(xiǎn)性2例(2.0%)，低度侵襲危險(xiǎn)性12例(12.3%)，中度侵襲危險(xiǎn)性23例(23.5%)和高度侵襲危險(xiǎn)性61例(62.2%)。

2.2 KIT和PDGFRA基因的原發(fā)突變 98例患者中共檢出突變82例：KIT突變79例(80.6%)，其中外顯子11突變61例 (62.2%)，外顯子9突變18例 (18.4%)；PDGFRA外顯子18突變3例 (3.1%)。KIT和PDGFRA各外顯子均未檢測(cè)到突變者16例(16.3%)。本組患者檢出KIT外顯子11突變形式主要為缺失突變，共61 例，突變主要集中在近5’端，缺失3～61個(gè)堿基不等，同時(shí)以密碼子557-558缺失最常見(11例，18.0%)，導(dǎo)致6個(gè)核苷酸TGGAAG缺失，編碼色氨酸(Trp)和賴氨酸(Lys)。其次，點(diǎn)突變18例(29.5%)，其突變主要發(fā)生于密碼子557、558和576。經(jīng)檢測(cè)，KIT外顯子9突變的18例患者中，均為插入/串聯(lián)重復(fù)，其中16例為密碼子502～503的6個(gè)編碼丙氨酸(Ala)和酪氨酸(Tyr)的核苷酸GCCTAT插入重復(fù)，而另外2例為罕見的密碼子501～502插入重復(fù)，重復(fù)的6個(gè)核苷酸為TCTGCC，編碼絲氨酸(Ser)和丙氨酸 (Ala)。

本組患者檢出PDGFRA突變均為第18號(hào)外顯子的基因突變,其中2例為常見的D842V點(diǎn)突變形式，1例為一個(gè)新的突變形式:氨基酸843～846處IMHD的框內(nèi)缺失,隨后伴有一個(gè)S847T的點(diǎn)突變。3例均為高度侵襲危險(xiǎn)性，所有患者未檢出PDGFRA第12號(hào)外顯子的突變。

根據(jù)不同性別、年齡及明確惡性和潛在惡性的GIST患者分組，分別比較總突變檢出率、KIT外顯子11、外顯子9及PDGFRA外顯子18突變發(fā)生率，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)；而不同原發(fā)部位GIST基因突變差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。胃和直腸患者GIST KIT外顯子11突變發(fā)生率顯著高于小腸(包括十二指腸，P<0.05)；小腸GIST外顯子9和野生型的發(fā)生率高于胃和直腸GIST，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 不同原發(fā)部位GIST突變檢測(cè)結(jié)果比較 [例(%)]

2.3 KIT和PDGFRA基因的二次突變 本研究組發(fā)現(xiàn)65例伊馬替尼繼發(fā)耐藥患者，經(jīng)過基因檢測(cè)，KIT基因發(fā)生二次突變4例，突變表現(xiàn)為同一種類型，即在KIT基因第17外顯子同一處堿基發(fā)生替換突變，表現(xiàn)為密碼子第2467位點(diǎn)的T為G所替換(T2467G)，可導(dǎo)致第823密碼子編碼氨基酸由酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?Y823D)。在所有被檢測(cè)的患者中，未發(fā)現(xiàn)KIT基因第9、11、13號(hào)外顯子及PDGFRA基因第12、18外顯子二次突變。

3 討 論

GIST發(fā)病率相對(duì)較低，國內(nèi)關(guān)于GIST患者突變情況的大宗病例報(bào)道仍然較少。國外研究顯示，GIST患者KIT基因突變發(fā)生率為75%～80%，主要發(fā)生于近膜區(qū)結(jié)構(gòu)域(外顯子11)；外顯子11突變率約為67%，外顯子9突變率約為10%，而PDGFRA基因突變率為5%～8%[10]。國內(nèi)超過100例患者的報(bào)道顯示了KIT總突變率和外顯子11突變率與國外報(bào)道類似，而外顯子9和PDGFRA突變率相對(duì)較低，分別為5%～7%和3%～4%。而我院KIT總突變發(fā)生率為80.6%，外顯子11突變率62.2%，PDGFRA突變率為3.1%，與文獻(xiàn)報(bào)道相近；但外顯子9突變率為18.4%。目前GIST突變檢測(cè)尚未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，變性高效液相色譜法和直接測(cè)序等不同檢測(cè)方法的突變檢出率可能存在一定差異[11]。

KIT不同突變類型發(fā)生頻率由高到低的是：缺失突變、點(diǎn)突變、重復(fù)突變以及插入突變。多數(shù)缺失突變集中在KIT外顯子11的5’端，而重復(fù)突變常發(fā)生在KIT外顯子11的3’端。 本組患者KIT突變的總體情況和文獻(xiàn)報(bào)道相近。點(diǎn)突變主要累及557、558和576幾個(gè)位點(diǎn)。本組外顯子9突變發(fā)生率與西方報(bào)道接近，也主要發(fā)生在小腸GIST，較胃GIST發(fā)生率高，盡管差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但本組新發(fā)現(xiàn)2例密碼子501和502重復(fù)，尚鮮見報(bào)道。本組患者檢出PDGFRA的突變均為第18號(hào)外顯子的基因突變，其中2例為常見的D842V點(diǎn)突變形式[11，12]。另1例是一個(gè)新突變形式：氨基酸843～846處IMHD的框內(nèi)缺失，隨后伴有一個(gè)S847T的點(diǎn)突變。3例具有PDGFRA突變者均為高度侵襲危險(xiǎn)性，未檢出PDGFRA第12號(hào)外顯子的突變，這也與西方報(bào)道相類似。

本次研究的結(jié)果表明, KIT基因原發(fā)突變發(fā)生在第11外顯子的患者，對(duì)伊馬替尼的療效要比其他KIT基因突變亞組的好，發(fā)生二次突變的風(fēng)險(xiǎn)卻比KIT基因第13號(hào)外顯子突變的患者高。因此, 在嚴(yán)密監(jiān)測(cè)伊馬替尼耐藥腫瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)的KIT基因新的二次突變, 可以為二者之間的因果聯(lián)系提供令人信服的證據(jù)。由于本次研究的病例數(shù)較少, KIT基因第9、13、17號(hào)外顯子及PDGFRA基因第12、18外顯子原發(fā)突變的繼發(fā)耐藥患者發(fā)生二次突變的概率還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述, 在使用伊馬替尼治療GIST以前, 除了確定CD117檢測(cè)結(jié)果外, 同時(shí)行基因檢測(cè)了解患者的基因突變情況,有助于預(yù)測(cè)伊馬替尼的療效與耐藥情況，可以為患者制定治療方案提供依據(jù)。

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Gastrointestinalstromaltumormoleculartargetedtreatmentforsecondaryresistancemutations

SHILiangang,MAChi,WANGDong.

DepartmentofGeneralSurgery,DalianCentralHospital,Dalian116033,China

ObjectiveTo investiate the gastrointestinal stromal tumor (GIST) patients with tyrosine kinase receptor (KIT) and platelet-derived growth factor receptor (PDGFRA) gene mutation characteristics, as well as secondary imatinib resistance mechanisms.Methods98 cases of patients with GIST tumor were examed with tissue for DNA extraction, polyme-rase chain reaction (PCR) amplification and direct sequencing to detect KIT exon 9,11,13,17 and PDGFRA gene mutation in exon 12, 18; and secondary second test were performed in 65imatinib-resistant patients.ResultsIn the 98 patients, KIT mutations were found in 79cases (80.6%), of which exon 11 mutations in 61 cases (62.2%), exon 9mutations in 18 cases (18.4%); PDGFRA mutations in 3 cases (3.1%). Gender, age, and among patients with advanced GIST GIST patients and potentially malignant mutation was with no significant difference (P>0.05); while different parts of GIST KIT exon 11 mutation incidence was significantly (P<0.05). In 65cases of secondary resistant cases, four patients developed a secondary mutation, gene expression of KIT exon 17 codon 2467 point T is replaced by G (T2467G), resulting in 823 amino acids encoded by the codons casein converted to aspartic acid.ConclusionIt demonstrated that the KIT mutations are common in GIST patients, between different parts of the KIT exon 11 mutation rate difference was statistically significant. Secondary imatinib resistance may be associated with KIT exon 17 of the gene codon 2467 point T is replaced by G (T2467G) related.

Gastrointestinal stromal tumor; Imatinib; Gene mutation; Drug resistance

116033 大連市中心醫(yī)院普外一科

10.3969/ j.issn.1671-6450.2014.02.021

2013-08-01)