臍血干細胞移植對失代償期肝硬化肝功能及血流動力學的影響

王可敬，羅曉紅，孫厚坦，王方，包建濤

論著·臨床

臍血干細胞移植對失代償期肝硬化肝功能及血流動力學的影響

王可敬，羅曉紅，孫厚坦，王方，包建濤

目的觀察臍血干細胞移植治療失代償期肝硬化的療效及對肝血流動力學的影響。方法選擇失代償期肝硬化患者30例為治療組，經(jīng)肝固有動脈進行異體人臍血干細胞移植；選擇資料匹配的同期住院未行臍血干細胞輸注的失代償期肝硬化患者20例作為對照組。比較2組患者肝功能、凝血功能、門靜脈血流動力學、B型超聲肝臟體積及造影劑消退時間等指標，并觀察患者臨床癥狀改善情況及不良反應。結(jié)果治療組肝內(nèi)臍血干細胞移植成功率為100%，無不良反應和并發(fā)癥發(fā)生。與治療前比較，2組治療后3、6個月谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(Alb)均有改善(P<0.05)，且治療組Alb改善優(yōu)于對照組(P<0.05)；與治療前比較，治療組治療3、6個月總膽紅素(TBil)明顯降低，對照組治療6個月時降低(P<0.05)；治療組治療1、3、6個月后甲胎蛋白(AFP)明顯增加，且與對照組同時點比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與移植前比較，治療組凝血酶原時間(PT)于移植后3 、6個月顯著下降(P<0.05)，與對照組比較差異顯著(P<0.05)；纖維蛋白原(Fib)在移植后3、6個月顯著增加(P<0.05)，與對照組比較差異不顯著(P>0.05)。凝血活酶時間(APTT)和凝血時間(TT)在移植后均呈降低趨勢，但與移植前差異不顯著，對照組亦無明顯變化(P>0.05)。與治療前比較，2組門靜脈內(nèi)徑(DPV)、脾靜脈內(nèi)徑(DSV)、門靜脈最大流速(PVX)、脾靜脈最大流速(SVV)、門靜脈血流量(QPV)、脾靜脈血流量(QSV)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后，2組肝臟體積均有增大趨勢，但比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05) 。與治療前比較，臍血干細胞移植后，治療組造影劑消退時間明顯減慢(P<0.05)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論經(jīng)肝固有動脈行臍血干細胞移植治療失代償期肝硬化可以改善肝功能及靜脈血流情況，且安全有效，為臨床肝病的治療探索了新途徑。

臍血干細胞；肝硬化；失代償期；血流動力學

近年來，隨著干細胞研究的不斷深入，采用干細胞治療終末期肝病顯示出良好的應用前景。Yang等[1]研究證實，臍帶血干細胞可分化為肝細胞，使臍血干細胞移植治療肝臟疾病成為可能。研究表明，與外周血及骨髓干細胞相比，臍帶血干細胞移植比例更高、自我繁殖能力強更、繁殖速度更快[2]?，F(xiàn)將臍帶血干細胞經(jīng)肝固有動脈移植于失代償期肝硬化患者，觀察臍血干細胞治療的療效及對肝靜脈血流動力學的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年2月—2013年4月我院住院的失代償期肝硬化并行臍血干細胞治療患者30例為治療組，選取同期住院未行臍血干細胞治療的失代償期肝硬化患者20例為對照組。所有病例均符合失代償期肝硬化診斷標準。治療組男21例，女9例；年齡42～70歲，中位數(shù)53歲；乙型肝炎后肝硬化20例，酒精性肝硬化4例，丙型肝炎后肝硬化3例，膽汁性肝硬化3例；肝功能Child分級：B級10例，C級20例。對照組男14例，女6例，年齡41～70歲，中位數(shù)52歲；乙型肝炎后肝硬化15例，酒精性肝硬化2例，丙型肝炎后肝硬化2例，膽汁性肝硬化1例；肝功能Child分級：B級6例，C級14例。2組患者性別、年齡、肝功能分級、肝硬化類型等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)，具有可比性。所有患者均知情同意并簽署知情同意書，且治療組簽訂《臍血干細胞移植治療同意書》，治療方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 臍血干細胞采集 選擇本院收治的健康產(chǎn)婦，排除乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒及其他傳染病，無病理妊娠。胎兒娩出并斷臍后，常規(guī)消毒采血部位，以封閉式采血法采血并裝入有ACD-B保存液的一次性采血袋，每袋采臍血約80～160 ml備用。用負收集法分離提取臍帶血干細胞，試劑盒由寧夏中聯(lián)達生物有限公司提供。在嚴格無菌條件下，按照操作步驟進行分離提取，每例提取的臍帶血干細胞總數(shù)要高于(1.6～7.3)×109，將分離好的細胞用5 ml生理鹽水稀釋，立即進行干細胞移植。

1.3 治療方法 對照組20例病毒性肝炎后肝硬化患者依據(jù)我國慢乙肝防治指南，失代償期乙型肝炎肝硬化給予口服抗病毒、保肝等治療，失代償期丙型肝炎后肝硬化、酒精性肝硬化、膽汁性肝硬化的病例常規(guī)給予保肝、改善肝臟微循環(huán)及對癥等治療。治療組在放射介入條件下，經(jīng)股動脈穿刺插管至肝固有動脈，選擇性肝固有動脈造影排除肝癌后，將制備好的臍血干細胞懸液按脈沖方式經(jīng)肝固有動脈輸入，術(shù)后穿刺點常規(guī)加壓、包扎，患者穿刺肢制動24 h。術(shù)后常規(guī)靜脈滴注促肝細胞生長素1周。

1.4 觀測指標 于術(shù)前造影觀察造影劑消退時間，術(shù)后3、6個月再次造影評估造影劑消退時間。

1.4.1 肝功能和凝血功能測定： 各組患者于手術(shù)當天和術(shù)后1周、1個月、3個月、6個月之日晨起空腹取肘靜脈血5 ml，所有血樣均用30 μl 10% EDTA和40 μl抑肽酶抗凝，靜止30 min后4℃離心，收集血清保存于-80℃待測。肝功能指標采用日立7080型全自動生化分析儀測定，包括谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、白蛋白(Alb)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBil)和甲胎蛋白(AFP)水平，試劑盒購于上海生物儀器有限公司。凝血指標采用日本SYSMEX血凝儀(CA-50)檢測，包括凝血酶原時間(PT)、纖維蛋白原(Fib)、活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血時間(TT)，試劑盒購于上海太陽生物技術(shù)有限公司。以上檢測嚴格按照試劑盒說明書進行操作，同一階段標本均在同一批測定中完成。

表1 2組肝硬化患者肝功能各指標的變化情況

注：與治療前比較，aP<0.05;與對照組治療后同時點比較，bP<0.05

1.4.2 血流動力學參數(shù)測定： 使用Siemens Acuson Sequoia 512型彩色多普勒超聲診斷儀探測門靜脈(PV)、脾靜脈(SV)，取樣長度2 cm，測出血管左右徑(A)和前后徑(B)，計算血管截斷面積(S)，公式為：S=(A×B×π)/4。血流速度(V)則以流速方向為主軸，相當于血管中心部超聲所測得流速微血管最大流速Vmax。血流量參數(shù)(Q)計算公式為：Q=S×(0.57×Vmax)/COS×60(ml/min)，同一患者每次受檢時取樣線與血流夾角保持相同，于平靜呼吸吸氣位屏氣時分別檢測脾靜脈內(nèi)徑(DSV)、脾靜脈流速(SVV)、脾靜脈血流量(QSV)，取3個心動周期的平均值為觀察值。

1.4.3 肝臟體積測定： 使用Siemens Sensation 16層螺旋CT機，常規(guī)CT平掃全肝，圖像選用Wizard工作站的Volume軟件處理，自動快速獲取肝臟體積。

1.4.4 造影劑消退時間觀察： 使用Siemens Acuson Sequoia 512型彩色多普勒超聲診斷儀，造影劑為SonoVue(意大利BRacco公司)，使用前用5 ml 0.9%氯化鈉溶液溶解，混勻后吸取2.4 ml快速注入肘靜脈，立即開始實時記錄造影劑的消退時間。

2 結(jié) 果

2.1 臍血干細胞移植成功率及不良反應 治療組30例患者肝內(nèi)臍血干細胞移植成功率100%，未見發(fā)熱、白細胞降低，穿刺部位無出血及滲出，未見肝區(qū)疼痛者。術(shù)后未發(fā)生與移植相關(guān)的不良反應和并發(fā)癥。

2.2 肝功能變化 與治療前比較，2組治療后3、6個月ALT、AST均改善(P<0.05)，2組比較差異不顯著(P>0.05)；與治療前比較，治療組治療后3、6個月2組Alb均明顯升高(P<0.05)，且治療組優(yōu)于對照組(P<0.05)。與治療前比較，治療組3、6個月TBil顯著降低(P<0.05)，對照組治療6個月下降(P<0.05)。與治療前比較，治療組治療后1、3、6個月AFP明顯增加 (P<0.05)，與對照組比較差異有顯著意義(P>0.05)。見表1。

2.3 凝血功能變化 與治療前比較，治療組PT于治療后3、6個月顯著下降(P<0.05)，與對照組比較差異顯著(P<0.05)；Fib在治療后逐步增加至正常，在治療后3、6個月顯著增加(P<0.05)，與對照組比較差異不顯著(P>0.05)。APTT和TT在治療后均呈降低趨勢，但與治療前比較差異不顯著(P>0.05)，與對照組比較差異亦不顯著(P>0.05)。對照組除治療后6個月PT、Fib改善外，余指標均無明顯變化(P>0.05)。見表2。

2.4 門靜脈系統(tǒng)血流動力學變化 與治療前比較，肝細胞移植6個月后，治療組門靜脈內(nèi)徑(DPV)和DSV均有一定程度下降，但差異不顯著(P>0.05)，與對照組比較，差異亦不顯著(P>0.05)。門靜脈最大流速(PVX)、SVV在移植后呈增快趨勢，但與治療前比較差異不顯著(P>0.05)，與對照組比較差異亦不顯著(P>0.05)。此外，治療后QSV、門靜脈血流量(QPV)也呈下降趨勢，與治療前和同期對照組比較差異不顯著(P>0.05)。見表3。

表2 2組肝硬化患者凝血功能各指標的變化情況

注：與治療前比較，aP<0.05;與對照組治療后同時點比較，bP<0.05

表3 2組肝硬化患者門靜脈系統(tǒng)血流動力學參數(shù)變化

表4 2組肝硬化患者治療前后肝臟體積變化

2.5 肝臟體積測定 治療后，治療組、對照組肝臟體積均有增大趨勢，但與治療前比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05) 。見表4。

2.6 造影劑消退時間 與治療前比較，臍血干細胞移植后，治療組造影劑消退時間明顯減慢(P<0.05)，與對照組比較差異顯著(P<0.05)。見表5。

表5 2組肝硬化患者治療前后造影劑消退時間變化情況

注：與治療前比較，aP<0.05；與對照組治療后同時點比較，bP<0.05

3 討 論

我國約有3 000多萬慢性乙型肝炎患者，其中約20%發(fā)展為肝硬化，僅失代償期肝硬化患者就多達630余萬人，每年病死率為20%～50%，且呈逐年上升趨勢[3]。如何改善失代償期肝硬化患者肝功能是臨床研究的難點和熱點，近年來，現(xiàn)代外科手術(shù)和移植相關(guān)技術(shù)發(fā)展迅猛，使肝臟移植成為治療失代償期肝硬化的重要手段，但三大“瓶頸”也制約了這項技術(shù)的廣泛開展和應用：(1)肝臟供體長期缺乏，以2010年為例，潛在適合肝移植患者中，僅有2 144例患者接受肝移植治療[4]，每年有大量的患者在等待器官移植中死亡。(2)免疫排斥反應大，是導致肝移植后死亡的最主要原因；其次，肝移植后患者需終身服用免疫抑制劑，可導致機體免疫功能低下、肝腎功能受損、繼發(fā)感染等。(3)器官移植醫(yī)療費用高，普通家庭難以承擔，也是導致肝臟移植無法廣泛開展的重要原因之一。

近年來，隨著干細胞技術(shù)和再生醫(yī)學的發(fā)展，大量的資料表明干細胞移植治療肝臟疾病是有效的，為失代償期肝硬化提供新的前景[5～8]。干細胞是人體內(nèi)最原始的未分化細胞，具有自我復制功能及多分化潛力，在一定條件下可以分化為多種功能細胞。Beerheide等[9]將干細胞用熒光染色后移植到小鼠的肝臟內(nèi)，移植后1周發(fā)現(xiàn)這些干細胞已整合到小鼠的肝臟組織里面，并檢出了人源性的白蛋白。大量研究表明，在肝損傷及肝細胞再生過程中，干細胞起著重要的作用，將干細胞移植到肝病患者肝內(nèi)，可使其在肝臟中分化為具有功能的肝實質(zhì)細胞，使損傷的肝功能恢復和重構(gòu)[10，11]。干細胞可以分為胚胎干細胞、臍血干細胞和成人干細胞，成人干細胞主要包括骨髓干細胞、外周血干細胞及神經(jīng)干細胞等，其中用于肝硬化移植研究的主要為骨髓干細胞。胚胎干細胞具有極強的可塑性和增殖能力，但存在倫理上的分歧、異體抗原、無限增殖的潛力和導致惡性腫瘤的發(fā)生等諸多問題。自體骨髓干細胞是一種很好的移植干細胞，趙和平等[12]利用骨髓干細胞治療肝硬化也取得了一定的療效，但細胞數(shù)量及質(zhì)量一直是影響其治療效果的關(guān)鍵因素。自體骨髓干細胞治療需要采集自體骨髓，患者需承擔骨髓穿刺風險及穿刺痛苦，且采集骨髓干細胞的質(zhì)量還受年齡限制，這些因素在一定程度上制約了自體骨髓干細胞治療的發(fā)展。

臍血單個核細胞來源于新生兒臍血，其來源廣泛、免疫原性低、提純效果好、移植排斥發(fā)生率低，且不受倫理道德限制，是近年來國內(nèi)外的研究熱點[13]。研究發(fā)現(xiàn)臍血中可移植干細胞比例明顯高于成人骨髓及外周血，且與骨髓干細胞相比自我繁殖能力更強、速度更快。臍血干細胞具有橫向分化能力，實驗證明在一定條件下，臍血干細胞可被誘導分化為脂肪細胞、肌細胞、心肌細胞、軟骨細胞、骨細胞、神經(jīng)細胞及肝細胞等[3]。Doan等[14]實驗發(fā)現(xiàn)臍血干細胞培養(yǎng)在肝細胞微環(huán)境下可以檢測到這些細胞能表達肝細胞表面標志如Alb、CK18、Thy-I、c-kit等，并通過對比得出臍血來源的間充質(zhì)干細胞比骨髓來源的干細胞更具有臨床及實用價值。

Zhang等[15]研究顯示，與注射生理鹽水對照組相比較，利用臍血干細胞治療失代償期肝硬化，可明顯改善患者肝功能，提高患者生活質(zhì)量。

肝臟是人體合成和代謝的主要場所，ALT、AST、Alb、TBil、AFP等指標是反映肝臟合成和代謝能力的主要指標。本結(jié)果顯示，臍血干細胞移植后患者的肝功能明顯改善，臍血干細胞移植對失償期肝硬化的治療明顯優(yōu)于其他治療方法；并且改善了患者凝血功能；在一定程度降低了門靜脈阻力；但肝臟均有一定程度增大，且增大程度大于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義；結(jié)合肝臟體積與血流動力學參數(shù)來看，肝臟體積的增大并未增加門靜脈高壓。綜合各指標比較后發(fā)現(xiàn)，干細胞移植后，移植組的治療效果顯著優(yōu)于對照組，且移植后患者并未出現(xiàn)與移植相關(guān)的嚴重不良反應和并發(fā)癥，這些都表明個體化干細胞移植治療失代償期肝硬化是可行的。

隨著肝硬化發(fā)病機制和干細胞治療相關(guān)研究的不斷深入，大量臨床數(shù)據(jù)證實干細胞在修復受損肝細胞、恢復肝功能及治療肝功能衰竭方面具有重要意義。但臨床上，干細胞的移植途徑、最佳移植時間和療程次數(shù)等還需進一步探討和研究。

綜上所述，本研究對臍血干細胞移植治療失代償期肝硬化的療效和肝血流動力學進行了細致的分析總結(jié)，試驗結(jié)果初步顯示經(jīng)肝固有動脈行臍血干細胞移植能改善肝臟合成功能，促進肝組織再生，改變門靜脈血流動力學并促進新血管重建，提示肝固有動脈輸注臍血干細胞治療失代償期肝硬化安全、簡單、有效，為臨床肝病治療探索了新的途徑。

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Effectoflivervolumeandliverhemodynamicsofhumanumbilicalcordbloodstemcelltransplantationondecompensatedcirrhosis

WANGKejing,LUOXiaohong,SUNHoutan,WANGFang,BAOJiantao.

DepartmentofEndocrinology，LanzhouMilitaryRegionGeneralHospital,Lanzhou730030,China

ObjectiveTo observe the therapeutic effect of umbilical cord blood stem cells transplantation in the treatment of decompensated cirrhosis of the liver and the effects on liver hemodynamics.Methods30 cases of patients with decompensated liver cirrhosis as treatment group, underwent the proper hepatic artery allogeneic umbilical cord blood stem cell transplantation; chosen the data matched 20 cases of patients with decompensated cirrhosis who did not receive the injection of umbilical cord blood stem cells treatment as the control group. Liver function, coagulation function, hemodynamics of portal vein, B ultrasound contrast agent was compared between the 2 groups of patients. The time of the liver volume and other indicators, the clinical symptoms and adverse reaction were observed.ResultsThe success rate of intrahepatic umbilical cord blood stem cell transplantation was 100% in the treatment group, no adverse reaction and complication were occurred. Compared with before treatment, after the treatment in the 2 groups, 3, 6 months of glutamate aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), albumin (Alb) were improved (P<0.05), and the Alb in the treatment group was better than the control group (P<0.05); and compared with before treatment, in the treatment group, 3, 6 months of total bilirubin (TBil) decreased significantly, control group reduces at 6 months after treatment (P<0.05); in treatment group, 1, 3, 6 months later, AFP significantly increased, compared with the control group at the same time, the difference was statistically significant(P<0.05).Compared with the treatment group before transplantation,prothrombin time(PT)after transplantation in 3, 6 months was significantly decreased (P<0.05), the difference was significant compared with control group (P<0.05); fibrinogen (Fib) in 3, 6 months after transplantation was significantly increased (P<0.05), compared with the control group, the difference was not significant (P>0.05). Thromboplastin time (APTT) and prothrombin time (TT) after transplantation showed a decreasing trend, but with no significant difference before transplantation, the control group had no significant changes (P>0.05). Compared with before treatment, 2 groups of portal vein diameter (DPV), splenic vein (DSV), portal vein flow velocity (PVX), splenic vein (SVV), portal venous blood flow (QPV), splenic vein blood flow (QSV) did not show statistically significant differences (P>0.05). After treatment, 2 groups of liver volume were showing increasing trend, but no significant difference were found (P>0.05). Compared with before treatment, umbilical cord blood stem cell transplantation, the treatment group contrast agent subsided significantly slow down (P<0.05), compared with the control group, a statistically significant difference were found (P<0.05).ConclusionThe proper hepatic artery umbilical cord blood stem cell transplantation in the treatment of decompensated cirrhosis can improve liver function and blood flow, is a new approach for the treatment of liver diseases.

Umbilical cord blood stem cells; Liver cirrhosis; Decompensation; Hemodynamics

甘肅省自然科學基金項目(No.1208RJZA062)

730070 蘭州軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.11.008

2014-05-17)