李五一 ，徐 萌，劉建國，羅國煒

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬第五醫(yī)院 口腔科，廣東 珠海 519125；2.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 口腔系，廣東 珠海 519041；3.遵義醫(yī)學(xué)院 口腔學(xué)院，貴州 遵義 563099；4貴州省高等學(xué)校 口腔疾病研究特色重點實驗室，貴州 遵義 563099；5.香港中文大學(xué) 病理解剖及細(xì)胞學(xué)系，威爾斯親王醫(yī)院，華南國家腫瘤重點實驗室，香港 999077)

病毒載體(Viral vectors)是一種常使用于分子生物學(xué)的工具，利用病毒具有傳送其基因組進入其他細(xì)胞，進行感染的原理,將遺傳物質(zhì)帶入細(xì)胞, 主要應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、基因療法或疫苗。目前基因工程常用的病毒可分為逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒與腺病毒。與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相比較，慢病毒載體最大的優(yōu)點就是可以感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞,可轉(zhuǎn)染難轉(zhuǎn)染細(xì)胞，解決轉(zhuǎn)染效率低的問題。正常的鼻咽上皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率低且不穩(wěn)定，后續(xù)實驗效果差。本研究擬采用第3代慢病毒載體系統(tǒng)感染鼻咽上皮細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)癌基因肽脯氨酰異構(gòu)酶PIN1的鼻咽上皮細(xì)胞株，免疫熒光、RT-PCR、westernblot檢測目的基因PIN1的表達(dá)，為下一步進行相關(guān)的功能學(xué)實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 正常鼻咽上皮細(xì)胞株NP69、293TN細(xì)胞，由香港中文大學(xué)鼻咽癌研究室保存。角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(Keratinocyto serm-free medium，KSFM)、牛腦垂體提取液(BPE)、重組表皮生長因子(rEGF)購自invitrogen。RPIM-1640培養(yǎng)液購自Sigma，10% 胎牛血清購自Gibico。Lipofectamine2000 脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑，購自life technologies公司。Lenti Starter kit第3代慢病毒包裝系統(tǒng)，購自system biosciences。RNA抽提試劑TRIZOL，購自invitrogen，RT-qPCR試劑盒，Westernblot 相關(guān)試劑購自life technologies。BCA蛋白含量測定試劑盒，購自Pierce。PIN1引物和Actin引物由life technologies公司合成。慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-PIN1(pCDH-PIN1)及pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(pCDH)由香港大學(xué)Dr.RobertaPang 惠贈。

1.2 方法

1.2.1 PIN1過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建 將3×106293TN細(xì)胞接種到10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在含10%胎牛血清無抗生素的RPIM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。待293TN細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時加入2 μg的pCDH-PIN1或pCDH、10 μg pACKH1-Plamid mix、及Lipofectamine2000進行共轉(zhuǎn)染，48 h后收集含有PIN1病毒顆粒的培養(yǎng)液。按照1∶5的最終體積比加入PEG-it析出病毒顆粒。離心，收集病毒顆粒，PBS重懸，-80 ℃保存。

將NP69接種到T25培養(yǎng)瓶中，于含有BPE及rEGF的KSMF培養(yǎng)液中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到50%～70%融合時，吸出原有培養(yǎng)液，換入含有PIN1病毒顆粒及TransDuxand混合物新培養(yǎng)液共培養(yǎng)。72 h后換入新的培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。熒光顯微鏡下隨機檢測6個高倍視野,記錄熒光顯微鏡下含有GFP細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，確定NP69中PIN1的導(dǎo)入情況。

1.2.2 引物設(shè)計 采用Applied Biosysem系統(tǒng)設(shè)計PIN1引物和Actin引物(見表1)。

表1 PIN1及Actin的引物序列

1.2.3 提取RNA 收集NP69-PIN1細(xì)胞，加入1 mL TRIZOL，200 μL氯仿，混勻15 s，室溫靜置2～3 min。離心，取含有RNA的水相上清，轉(zhuǎn)入干凈新試管。加入異丙醇，離心，得到沉淀的RNA，75%酒精洗滌，干燥。測定RNA的濃度。

1.2.4 RT-qPCR測定目的基因mRNA含量 取適量RNA加入1 μL DNaseI，室溫孵育15 min除去染色體DNA，加入1 μL EDTA，65 ℃10 min使DNaseI失活，將處理好的RNA用于cDNA合成。根據(jù)Taqman試劑盒說明，取適量RNA加入RT緩沖液、5.5 mm氯化鎂、500 μm dNTP、2.5 μm Random Hexamer、0.4 U/μL RNase抑制劑、1.25 U/μL Multiscribe逆轉(zhuǎn)錄酶。25 ℃10 min，48 ℃30 min，95 ℃5 min，合成cDNA。

根據(jù)SYBR Green Master Mix 試劑盒指引，取適量cDNA，加入SYBR Green Master Mix、Actin及PIN1引物，采用7500 Fast real-time PCR system 進行擴增，計算CT值。

1.2.5 Westernblot 檢測目的蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，加入RIPA(含有1%NP40、0.5%脫氧膽酸鈉和0.1%SDS的PBS)和蛋白酶抑制劑，冰上裂解蛋白20 min，離心取上清，BCA法測定蛋白濃度。取適當(dāng)?shù)鞍准尤隨DS上樣buffer, 煮沸5 min，冰上冷卻，SDS PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗、二抗，顯影，照片，檢測目的蛋白的表達(dá)情況。顯影結(jié)果經(jīng)Image J 軟件進行半定量分析,計算凈光密度值,結(jié)果以相對平均灰度值(Mean Gray Value MGV)×面積(mm2)表示。蛋白的相對含量=(目的蛋白條帶MGV×mm2)/(β-actin條帶MGV×mm2)

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況 統(tǒng)計NP69-PIN1細(xì)胞株中PIN1的轉(zhuǎn)染率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)94%±2.09%的NP69細(xì)胞攜帶PIN1，采用第3代慢病毒載體系統(tǒng)感染鼻咽上皮細(xì)胞效果理想(見圖1)。

A：倒置顯微鏡下圖像；B：熒光顯微鏡下圖像。圖1 PIN1在NP69中過表達(dá)

2.2 PIN1 mRNA的表達(dá)情況 采用RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)第3代慢病毒載體系統(tǒng)感染鼻咽上皮細(xì)胞的PIN1mRNA 表達(dá)水平是對照組的20～25倍，在轉(zhuǎn)錄水平上明顯提高了PIN1的表達(dá)量,具有統(tǒng)計學(xué)意義。(見圖2，具體相對CT比值的比較見表2)。

圖2 RT-qPCR檢測顯示PIN1 mRNA在NP69中過表達(dá)

表2鼻咽上皮細(xì)胞的PIN1mRNA相對CT比值的比較

組別相對CT比值均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差組別 相對CT比值均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差NP69lenti-vector 1±0.002512NP69lenti-vector 1±0.002512NP69lenti-PIN124.551±3.2719NP69 parental 1.559±0.3797t-12.467t-2.551P 0.000P 0.125

2.3 PIN1蛋白的表達(dá)情況 Westernblot檢測結(jié)果(見圖3)，分別在NP69parental、NP69-vector、NP69-PIN1組中檢測到相關(guān)蛋白。18KD處檢測到目的蛋白PIN1條帶，43KD處檢測到內(nèi)參β-actin。結(jié)果顯示經(jīng)第3代慢病毒載體系統(tǒng)感染鼻咽上皮細(xì)胞的PIN1蛋白表達(dá)量明顯高于對照和空白組，蛋白表達(dá)量分析(見表3)。

圖3 Westernblot檢測顯示PIN1在NP69中過表達(dá)

表3鼻咽上皮細(xì)胞中PIN1的蛋白相對含量

組別蛋白的相對含量均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 組別 蛋白的相對含量均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差NP69lenti-vector0.6224±0.07098NP69parental 0.3541±0.008642NP69lenti-PIN10.08528±0.00908NP69lenti-PIN10.08528±0.00908t6.548t-68.899P 0.003P 0.000

3 討論

肽脯氨酰異構(gòu)酶PIN1可特異性地催化蛋白質(zhì)中磷酸化的Ser/Thr-Pro酰胺鍵的順反異構(gòu),改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象 ,調(diào)控蛋白質(zhì)的活性，磷酸化狀態(tài)，蛋白與蛋白的相互作用,蛋白的穩(wěn)定及亞細(xì)胞定位,從而調(diào)節(jié)一系列與Serine-threonie相關(guān)的細(xì)胞信號通路，激活一系列腫瘤基因,生長因子;抑制抑癌基因和生長抑制因子,促進腫瘤的發(fā)生[1-3]。研究顯示PIN1可以在前列腺癌,宮頸癌,惡性黑色素瘤等多種腫瘤中高表達(dá), 且PIN1的高表達(dá)預(yù)示著較差的預(yù)后和較短時間的腫瘤復(fù)發(fā)[4]。

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)是一種與艾巴氏病毒(Epstein-Barr virus, EBV)密切相關(guān)的上皮性惡性腫瘤,為我國南方地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一[5]。EB病毒(EBV)感染、基因易感性和環(huán)境因素(飲食和非飲食)是鼻咽癌的三大誘因[6]。鼻咽癌放療后5年生存率 I～II期在60%以上， III～IV期則只有20%～40%[7], 因此早期發(fā)現(xiàn)對提高鼻咽癌的生存率至關(guān)重要。研究鼻咽癌早期發(fā)生的分子機制，揭示調(diào)控腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵信號分子，對改善鼻咽癌總體預(yù)后至關(guān)重要。課題組的前期免疫組化、Westernblot研究顯示PIN1在鼻咽癌組織中高表達(dá)。為了進一步研究PIN1 在鼻咽癌中的潛在作用，課題組擬在鼻咽上皮細(xì)胞系 NP69 中建立了PIN1 過表達(dá)細(xì)胞克隆株。建立基因過表達(dá)細(xì)胞克隆株通常有兩種常用的方法，一脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，二病毒載體轉(zhuǎn)染法，包括慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒[8]。慢病毒載體，以Ⅰ型HIV 為基礎(chǔ)，高效感染分裂期及非分裂期細(xì)胞( 優(yōu)于逆轉(zhuǎn)錄病毒) ，目的基因可整合至靶細(xì)胞基因組長期表達(dá)，同時具有較小的免疫反應(yīng)( 優(yōu)于腺病毒)，是目前較理想的基因轉(zhuǎn)移載體[9]。慢病毒載體的發(fā)展大致經(jīng)過3個階段：第1代慢病毒載體使用三質(zhì)粒系統(tǒng)，在構(gòu)建3種包裝質(zhì)粒時，為了降低產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒的可能性，盡可能減少3種質(zhì)粒之間的同源序列，但包裝質(zhì)粒中仍然保留了HIV的附屬基因。第2代慢病毒載體系統(tǒng)是在第1代基礎(chǔ)上的改進，在包裝質(zhì)粒中刪去了HIV的所有附屬基因，增加了載體的安全性。第3代慢病毒載體系統(tǒng)又增加了2個安全特性：一是構(gòu)建了自身失活的慢病毒載體，即刪除了U3區(qū)的3’ LTR，使載體失去HIV-1增強子及啟動子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出RNA；二是去除了tat基因，代之以異源啟動子序列，這樣原始的HIV基因組中的9個基因在慢病毒載體中只保留了3個( gag、pol和rev)[10]。第3代慢病毒載體系統(tǒng)更加安全,因此課題組采用第3代慢病毒載體感染鼻咽上皮細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)癌基因PIN1的鼻咽上皮細(xì)胞株。

熒光顯微鏡觀察慢病毒載體自帶的GFP熒光顆粒，發(fā)現(xiàn)PIN1基因已整合到94%±2.09%的NP69細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率高。經(jīng)過傳代培養(yǎng)30代后，仍可觀察到GFP熒光顆粒，轉(zhuǎn)染效果穩(wěn)定。RT-qPCR、Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)NP69-PIN1組中PIN1的mRNA和蛋白水平明顯高于對照組和空白組。本研究成功在鼻咽上皮細(xì)胞系 NP69 中構(gòu)建PIN1 過表達(dá)細(xì)胞克隆株NP69-PIN1，為進一步在細(xì)胞模型和動物模型中研究PIN1在鼻咽癌中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1] Lu K P,Hanes S D,Hunter T.A human peptidyl-prolyl isomerase essential for regulation of mitosis[J]. Nature,1996,380(6574):544-547.

[2] Liou Y C, Zhou X Z,Lu K P.Prolyl isomerase Pin1 as a molecular switch to determine the fate of phosphoproteins[J]. Trends Biochem Sci,2011,36(10):501-514.

[3] Lee T H, Pastorino L,Lu K P. Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase Pin1 in ageing, cancer and Alzheimer disease [J]. Expert Rer Mol Med,2011,13:e21.

[4] Bao L,Kimzey A,Sauter G,et al.Prevalent overexpression of prolyl isomerase Pin1 in human cancers[J].Am J Pathol,2004,164(5):1727-1737.

[5] Parkin D M, Pisani P,Ferlay J. Estimates of the worldwide incidence of 25 major cancers in 1990[J].Tnt J Cancer,1999,80(6):827-841.

[6] 劉紅剛，高巖.頭頸部腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué) [M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：91-111.

[7] Baujat, B, Audry H, Bourhis J, et al. Chemotherapy in locally advanced nasopharyngeal carcinoma: an individual patient data meta-analysis of eight randomized trials and 1753 patients [J]. Tnt J Radiat Oncol Biol Phys，2006,64(1)：47-56.

[8] Thorne B A, Takeya R K, Peluso R W.Manufacturing recombinant adeno-associated viral vectors from producer cell clones[J]. Hum Gene Ther，2009，20(7):707-714.

[9] Rothe M, Modlich U, Schambach A.Biosafety challenges for use of lentiviral vectors in gene therapy[J]. Curr Gene Ther，2013，13(6):453-468.

[10] Kurth R，Bannert N. Retroviruses: Molecular Biology, Genomics and Pathogenesis[M]. Caister Academic Press,2010:347-370.