施國民，徐 斐

C反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)是重要的急性期反應(yīng)標(biāo)志物［1］，在各種急性和慢性感染、組織損傷、惡性腫瘤、手術(shù)創(chuàng)傷時會迅速升高，病變緩解時又迅速降至正常水平［2-5］，因此廣泛應(yīng)用于細(xì)菌或病毒所致急性感染性疾病及其他各類炎癥性疾病的診斷和鑒別，手術(shù)后感染和抗生素療效的觀察，病情嚴(yán)重程度的監(jiān)測及預(yù)后判斷等［6-8］。

目前，臨床實驗室定量檢測CRP的方法主要有放射免疫測定法、酶聯(lián)免疫吸附法、膠乳免疫比濁法等。其中放射免疫測定法由于存在輻射污染，已較少應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附法耗時較長，不適合批量檢測。膠乳免疫比濁法分為透射比濁法和散射比濁法，前者用于生化分析儀，后者用于特定蛋白分析儀。特定蛋白分析儀比生化分析儀體積小巧，檢測耗時更短，數(shù)分鐘內(nèi)即可出結(jié)果，特別適用于門、急診和床邊監(jiān)護使用。目前特定蛋白分析儀的試劑多依賴于進口，價格較為昂貴。我們將CRP單克隆、多克隆抗體用EDC/NHS共價法與羧基化聚苯乙烯微球結(jié)合，制備出用膠乳免疫比濁法檢測CRP的試劑。本文對研制的CRP檢測試劑盒性能進行評價。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 血液樣本來源于南京市第一醫(yī)院和南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診檢驗科，按適用于臨床實驗室檢驗的方法采集，采集后及時測定。

1.2 儀器與試劑 CRP檢測試劑盒(膠乳免疫比濁法)為本實驗室自行研制，批號 20110707、20130117。CB100型特定蛋白分析儀為南京卡博生物科技有限公司生產(chǎn)。CRP質(zhì)控及校準(zhǔn)品購自比利時APTEC公司，質(zhì)控品濃度為5.3和20 mg/L，批號C3127。校準(zhǔn)品濃度為90和155 mg/L，批號S3134。牛血清白蛋白購自Roche公司。實驗所用的對比試劑、儀器為芬蘭GENE SCIENTIFIC公司生產(chǎn)的CRP高敏感干化學(xué)微粒增強型免疫比濁測定試劑盒，QuikRead 101型蛋白免疫分析儀。

1.3 實驗方法 按照《體外診斷試劑分析性能評估系列指導(dǎo)原則(征求意見稿)》［9］所規(guī)定的方法，測定對自制試劑盒的檢測限、精密度、線性范圍、回收率、貯存穩(wěn)定性，并與國外同類試劑盒進行200例臨床對比研究。

1.3.1 檢測限 用等滲鹽水制備5%牛血清白蛋白作為空白樣品，重復(fù)測定20次，計算均值及標(biāo)準(zhǔn)差，以空白均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差作為試劑盒的檢測限。

1.3.2 精密度 用5.3和20 mg/L濃度的質(zhì)控品評估試劑盒的精密度。每天上午、下午各進行1次測試，每次對同一樣品重復(fù)檢測3次，連續(xù)20天，分別計算批內(nèi)精密度和批間精密度。

1.3.3 線性范圍 將樣本稀釋為11個濃度:1、22.4、43.8、65.2、86.6、108.0、129.4、150.8、172.2、193.6、215 mg/L。在同一天內(nèi)用同一批號試劑盒對所有樣本測定4次，取其均值進行線性回歸分析。

1.3.4 回收率 取CRP濃度為20 mg/L的新鮮人血樣本，分為體積相同的3份，第一份加入10%體積90 mg/L的校準(zhǔn)品，第二份加入10%體積155 mg/L的校準(zhǔn)品，第三份加入10%體積的生理鹽水，每個樣本測試3次，計算平均回收率。以CLIA'88(美國臨床實驗室改進修正法規(guī)’88)的總允許誤差(TEa)為臨床可接受性標(biāo)準(zhǔn)，小于1/2TEa作為臨床可接受水平。

1.3.5 貯存穩(wěn)定性 用新配制的20130117批號試劑和穩(wěn)定期末的20110707試劑對2份CRP水平不同(7和20 mg/L)的新鮮人血清樣本同時測定6次，對兩組結(jié)果進行t檢驗，比較檢測結(jié)果的一致性。

1.3.6 與國外試劑盒比較 分別用自制試劑盒與對比試劑盒對200份血清樣本進行檢測，其中CRP異常的樣本60份，比較2種試劑盒的測定結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗。兩種試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)性用Pearson分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測限 為0.72 mg/L。

2.2 精密度 在5.3和20 mg/L兩個濃度水平的批內(nèi)變異系數(shù)分別為3.09%和6.75%，批間變異系數(shù)分別為6.47%和6.84%，符合市售試劑盒精密度要求(批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10%)，在臨床可接受范圍內(nèi)。

2.3 線性范圍 在濃度為1～215 mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，其直線回歸方程為 Y=21.799X－21.703，線性相關(guān)系數(shù)(r)=0.99。

2.4 回收率 平均回收率為112.5%，系統(tǒng)誤差(系統(tǒng)誤差=100%－平均回收率)為2.5%，小于1/2TEa，臨床可接受。

2.5 檢測試劑盒的貯存穩(wěn)定性 新配試劑與處于穩(wěn)定期末試劑對兩個水平的新鮮人血樣本測定所得結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。自制試劑盒貯存有效期為18個月，市售同類試劑盒一般為12個月，與之相比自制試劑盒的貯存有效期更長。

2.6 與國外試劑盒的比較 對自制試劑盒與對比試劑盒檢測200份樣本所得結(jié)果進行相關(guān)分析，結(jié)果顯示2種試劑盒相關(guān)性良好，線性回歸方程為Y=1.0347X－0.3894(r=0.997，P ＜0.01)。自制試劑盒檢測結(jié)果為(30.1±42.0)mg/L，對比試劑盒檢測結(jié)果為(30.6±43.5)mg/L，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

CRP是最重要的急性時相反應(yīng)蛋白之一，對于各種感染和炎癥過程、組織損傷與壞死及修復(fù)過程的評估與療效判斷都具有重要臨床價值［10］。我們對自制CRP檢測試劑盒的檢測限、精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、貯存穩(wěn)定性進行了評價。結(jié)果表明自制試劑盒測定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可滿足臨床檢測需求，價格較進口試劑低廉，適合大規(guī)模臨床推廣利用。

［1］稅國順，何代莉，楊曉紅.C-反應(yīng)蛋白的測定及臨床應(yīng)用［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2005，21(11):1365-1366.

［2］周 宓，潘柏申.C-反應(yīng)蛋白在臨床應(yīng)用中的進展［J］.國外醫(yī)學(xué):臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊，2005，26(1):56-57.

［3］楊 朵，胡 梅，李 莉，等.C-反應(yīng)蛋白及降鈣素原在血流細(xì)菌感染診斷中的應(yīng)用價值［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，23(22):5632-5633.

［4］余 豐，梁飛立，何艷英，等.C-反應(yīng)蛋白水平與HIV/AIDS患者抗病毒治療預(yù)后關(guān)系的研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，23(19):4616-4618.

［5］周志宇，韋成聰，趙冠焱，等.顱腦損傷后腦脊液C反應(yīng)蛋白動態(tài)變化及臨床意義［J］.中華實用診斷與治療雜志，2013，27(2):118-120.

［6］Clyne B，Olshaker JS.The C-reactive protein［J］.J Emerg Med，1999，17(6):1019-1025.

［7］Nashel DJ，Petrone DL，Ulmer CC，et al.C-reactive protein:a marker for disease activity in ankylosing spondylitis and Reiter’s syndrome［J］.J Rheumatol，1986，13(2):364-367

［8］葉應(yīng)嫵，王毓三.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.3版.南京:東南大學(xué)出版社，2006:121-122.

［9］國家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心.體外診斷試劑分析性能評估系列指導(dǎo)原則(征求意見稿)［Z］.2009-06-01

［10］宋 娜，張家云，余小紅，等.兩種檢測方法測定C反應(yīng)蛋白的比較［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2012，27(4):257-260.