葉 婷 綜述，劉靳波審校

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，四川瀘州646000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型，是最常見的惡性腫瘤之一，在全球消化系統(tǒng)腫瘤病死率中占第三位，其發(fā)病率呈上升趨勢［1］。肝癌最主要的病因是慢性肝炎病毒感染（HBV和HCV），肝硬化以及營養(yǎng)不良因素，毒素侵襲和代謝紊亂等。目前肝癌的診治有了很大進步，但其發(fā)病機制仍未完全闡明。隨著近年的研究發(fā)現(xiàn)，肝癌的發(fā)生發(fā)展除與基因突變有關(guān)外，表觀遺傳學異常亦起著重要作用，其中DNA甲基化是表觀遺傳學研究最為深入和廣泛的機制，在此對DNA甲基化與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及甲基化在肝癌臨床診斷與治療中的意義進行綜述。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化是典型的表觀遺傳學標志［2］。在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA中CG兩個核苷酸的胞嘧啶被選擇性的添加甲基基團，形成5-甲基胞嘧啶。在人類基因組中，DNA甲基化通常發(fā)生在基因的5′端啟動子和第1 外顯子“CpG島”區(qū)域，可引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用的改變，抑制基因轉(zhuǎn)錄和表達［3-4］。腫瘤的甲基化異常體現(xiàn)在廣泛的低甲基化、個別基因低甲基化、區(qū)域性高甲基化和印記丟失等。其中，普遍性低甲基化和區(qū)域高甲基化是基因異常表達的常見機制。DNA甲基化水平的整體減低影響Cp G雙核苷酸的重復序列（如長散步核元件1）以及某些基因特異性啟動子Cp G島［5］。DNA低甲基化會造成基因組的不穩(wěn)定，激活原癌基因（如ras、myc）及其他腫瘤促進基因的表達而誘發(fā)腫瘤。在Cp G島中常見的DNA高甲基化常引起基因轉(zhuǎn)錄沉默，使某些抑癌基因、DNA修復基因等失活，導致正常細胞調(diào)控失常及DNA損傷不可逆，從而促進腫瘤的形成。

2 DNA甲基化與肝癌的發(fā)生發(fā)展

2.1 DNA甲基化與肝癌的發(fā)生 腫瘤基因D N A甲基化是細胞癌變過程中一個早期、頻發(fā)事件，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，肝癌也不例外。盡管肝癌發(fā)生的分子機制尚不十分清楚，但越來越多的研究表明啟動子Cp G島的異常甲基化導致的抑癌基因失活與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有報道指出，肝臟線粒體內(nèi)尿素循環(huán)特異性的限速酶氨甲酰磷酸合酶Ⅰ型（carbamoyl phosphate synthetase 1，CPS1）在肝癌組織與癌細胞株中低表達，用甲基化抑制劑5-氮雜胞苷處理肝癌細胞，CPS1表達恢復［6］。DNA甲基化是沉默肝癌CPS1 表達的關(guān)鍵機制，CPS1 基因的高甲基化與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。Goeppert等［7］采用定量甲基化技術(shù)分別對肝硬化、癌前病變、肝細胞癌和正常肝組織中的A型激酶錨定蛋白12（A kinase anchor protein 12，AKAP12）進行了分析，發(fā)現(xiàn)抑癌基因AKAP12 在肝癌發(fā)生過程中分階段下調(diào)。不同的表觀遺傳學機制表明，在肝硬化與癌前病變階段miR-183與mi R-186上調(diào)靶標AKAP12，使其降低；肝癌時AKAP12α啟動子特異性的高甲基化導致抑癌基因AKAP12 顯著性下調(diào)。肝癌中SOX1 基因及分泌型卷曲相關(guān)蛋白啟動子區(qū)的高甲基化會導致Wnt／βcatenin 信號通路的失活。Tsao 等［8］采用甲基化特異性PCR檢測到SOX1 在Hep3B 肝癌細胞株與癌組織中因啟動子區(qū)高甲基化導致下調(diào)，SOX1 過表達將抑制肝癌細胞增殖、集落形成與侵襲的能力；另外運用熒光素酶報告分析與蛋白印跡分析證實SOX1 能夠抑制細胞外因子Wn t 下游基因的表達，通過干擾Wnt／β-catenin 信號通路發(fā)揮抑癌基因作用，影響肝癌的發(fā)生。Nishida 等［9］通過分析179例肝癌組織，178例配對非癌肝組織以及正常肝臟得出全基因組DNA低甲基化是肝癌形成的重要機制，在非丙肝性肝癌中較早發(fā)生；同時是引起肝癌形成早期染色體不穩(wěn)定的重要原因，尤其是非肝硬化演變的肝癌。因此，研究表明多種分子路徑機制與肝癌的發(fā)生相關(guān)，其中Cp G島甲基化路徑（Cp G island methylator pathyway，CIMP）、泛低甲基化與染色體不穩(wěn)定型路徑都被認為普遍存在，采用肝癌甲基化譜的分析是研究的主要技術(shù)手段。

2.2 DNA甲基化與肝癌的分期 肝細胞癌分期系統(tǒng)地提供了患者評價與治療措施的指南，是預測肝癌患者預后及臨床研究中根據(jù)預后變量進行疾病分類的主要依據(jù)。DNA甲基化異常在肝癌不同臨床分期有不同的特點及表現(xiàn)。Piao 等［10］采用甲基化特異性PCR及標記P704 的雜合性缺失研究等方法，檢測了39例肝細胞癌中抑癌基因RIZI 啟動子甲基化狀態(tài)，并對其甲基化狀態(tài)與臨床病理特征、腫瘤大小分化及片段等位基因缺失（fractional allelic loss，F(xiàn)AL）之間相關(guān)性作了評估。研究表明，RIZ1 基因啟動子在晚期肝癌（＞3 cm）與早期肝癌（＜3 cm）中都出現(xiàn)異常甲基化，分別是58.0%（18／31）與50.0%（4／8）；22例表現(xiàn)出高甲基化，在低分化（低FAL組）與高分化（高FAL 組）腫瘤中甲基化率分別為54.6%和45.5%，其中，4例RIZ1 雙等位基因高甲基化失活。Li 等［11］采用甲基化特異性PCR 研究10 種抑癌基因與CIMP在115例肝癌組織與48例非癌肝組織甲基化狀態(tài)，抑癌基因甲基化率P14為40.0%，P15為60.9%，P16為70.4%，P73為34.8%，GSTP1為70.4%，MGMT為64.3%，hMLH1為13.0%，RARbe t a為59.1%，SOCS-1 為82.6%，OPCML 為80.9%；CIMP 陽性（包含至少6 個甲基化基因）檢出率為59.1%（68／115）。進一步研究證實，TNM分期Ⅰ期CIMP陽性的肝癌患者總生存期與無瘤生存期相比CIMP 陰性的肝癌患者顯著性降低，并且多變量分析表明CIMP 陽性在TNM分期Ⅰ期的肝癌患者中可作為總生存期（HR＝12.266，P＝0.015）和無瘤生存期（HR＝20275，P＝0.032）的獨立預后因素。因此，CIMP 陽性可以明確解釋在TNM分期Ⅰ期療效不佳的肝癌患者，CIMP的檢測對早期肝癌患者預后分析與復發(fā)風險評估起著指導研究作用。

2.3 DNA甲基化與肝癌的轉(zhuǎn)移 肝癌的轉(zhuǎn)移是一個涉及多個基因、多步驟的變化過程，其關(guān)鍵機制的闡明將為預測和防止肝癌的轉(zhuǎn)移復發(fā)提供更堅實的基礎。有研究指出，主要分布于細胞膜上的CD44v6 基因在轉(zhuǎn)移性肝細胞癌樣本中表達高于非轉(zhuǎn)移組，且在肝癌細胞系Hep3B中CD44v6 基因完全甲基化，在具有轉(zhuǎn)移潛能的癌細胞株MHCC97H與MHCC97L則不完全甲基化［12］；因此DNA啟動子區(qū)的甲基化影響CD44v6 的表達，并與肝癌的轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）及其受體c-Met 調(diào)節(jié)正常肝細胞的生長和分化，HGF和c-Met 在肝癌中的上調(diào)與其發(fā)展和轉(zhuǎn)移息息相關(guān)。最近Ogunwobi 等［13］分離和建立來自鼠肝癌模型外周血的循環(huán)腫瘤細胞株，循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTCs）顯著增高了轉(zhuǎn)移性肝癌致瘤與轉(zhuǎn)移的潛能；其中HGF 和c-Met 在CTCs 中表達高于原發(fā)性肝癌細胞，HGF 和c-Met 過表達與c-Met 啟動子區(qū)6 個特異性CpG位點去甲基化相關(guān)。Lv 等［14］檢 測 了Hep G2與MHCC 97H肝 癌細胞株B 細胞易位基因3（B-cell translocation gene 3，BTG3）啟動子甲基化狀態(tài)，BTG3 可抑制肝癌細胞增殖、浸潤且誘導體外肝癌細胞G1／S 周期阻滯。研究表明BTG3 在LO2 肝細胞株與肝癌組織中低表達，是由于BTG3基因啟動區(qū)高甲基化；BTG3 的表達水平與肝癌分化及遠端轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，低BTG3 表達的患者總生存期縮短。

3 DNA甲基化與肝癌的診治

3.1 DNA甲基化與肝癌的診斷 相較于基因突變，DNA甲基化改變是細胞癌變過程中更為早期的事件，腫瘤組織壞死后分解的DNA進入外周血（血漿或血清）或其他體液（如唾液或痰等），因此檢測體液或組織中腫瘤相關(guān)基因甲基化狀態(tài)可應用于腫瘤的早期診斷。Tr ?nkenschuh 等［15］采用定量高分辨率焦磷酸測序，研究了15例纖維板層型肝癌（fibrolame carcinoma of liver，F(xiàn)LC）及配對正常肝臟組織中APC、CDH1、cyclin D2、GSTπ1、has-mir-9-1、has-mir-9-2 及RASSF1A基因的甲基化狀態(tài)指出，cyclinD2、RASSF1A、mir-9-1 及mir-9-2 基因在FLC 中甲基化頻率分別為19%、38%、13%和33%；而基因APC 與CDH1 在FLC 中未發(fā)現(xiàn)其甲基化及全基因組低甲基化的依據(jù)，這將為肝癌診斷的進一步分型提供分子依據(jù)。Nagashio 等［16］建立了以DNA甲基化譜為基礎的肝癌癌前診斷評估標準，結(jié)合DNA甲基化譜的診斷標準在受試組中診斷高致瘤風險的敏感性為95.6%，特異性為100%。近來有學者提出，游離的腫瘤特異性DNA異常甲基化分析為肝癌的早期診斷，開辟了又一無創(chuàng)檢測的最新技術(shù)手段。Sun 等［17］運用甲基化特異性PCR檢測血清中組織因子途徑抑制物2（tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI2）在肝癌組、慢性乙型肝炎組與正常對照組中的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示肝癌組血清TFPI2啟動子甲基化率為46.5%，明顯高于慢性乙型肝炎組（16.7%）和正常對照組（19.2%）；血清TFPI2 甲基化的檢測率為46.5%，非常接近有關(guān)報道的甲胎蛋白（AFP）的檢測率54%，聯(lián)合TFPI2啟動子甲基化和A FP標記物的檢測率為61.0%。因此，血清TFPI2的甲基化可能成為肝癌診斷的無創(chuàng)性生物分子標記物。另外Li 等［18］研究血清胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7（insulin-like growth factor binding protein-7，IGFBP7）啟動子甲基化在乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌中的診斷價值。研究中檢測136例肝癌患者、46例乙型肝炎患者及45例健康對照人群的血清IGFBP7 啟動子甲基化狀態(tài)，肝癌組甲基化率為65%（89／136）明顯高于乙型肝炎組的17%（8／46）及健康對照組的14%（5／35），血清IGFBP7 甲基化與AFP的檢測敏感性分別為65%和57%，聯(lián)合檢測敏感性達85%。

3.2 DNA甲基化與肝癌的治療 D N A甲基化由甲基轉(zhuǎn)移酶介導，針對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）活性及DNA甲基化模式改變，以此為基礎探討肝癌治療策略，可能成為肝癌治療領域的新思路。DNA甲基化抑制劑都是抗代謝藥物，主要包括：以DNMT作用底物為靶點的藥物，如胞苷類似物5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-Aza-CR）、5-氮 雜-2′-脫 氧 胞 苷（5-Aza-2′deoxycytidine，5-Aza-CdR）等；以DNMT輔助因子SAM為靶點的藥物，如SAM類似物西萘芬凈，抗SAM代謝物Neplanosin等；以及其他如甲氨蝶呤及其類似物、普魯卡因胺等。其中以5-Aza-CdR為代表的抑制劑已廣泛應用于逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的異常甲基化，使失活的基因重新表達。5-Aza-Cd R被整合到處于分裂期細胞核內(nèi)的核酸中形成共價鍵，從而抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶活性，不斷減弱細胞DNA甲基化的能力，使甲基化的抑癌基因重新活化。近來Tao 等［19］研究5-Aza-Cd R通過抑制肝癌細胞中端粒酶活性發(fā)揮抗腫瘤的作用。分別采用RT-PCR及Western-blot 檢測SMMC-7721 和HepG2 肝癌細胞株相關(guān)基因（如c-myc、p15、p16、p21、E2F1、WT1）的活性，端粒重復擴增酶聯(lián)免疫吸附法測定端粒酶的活性及DNA甲基化特異性PCR測定DNA甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)端粒酶活性在用5-Aza-Cd R處理過的兩種肝細胞癌中明顯降低，隨著端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，h TERT）的下調(diào)，h TERT啟動子的甲基化狀態(tài)在作用過5-Aza-CdR的SMMC-7721 肝癌細胞株中可逆轉(zhuǎn)，Hep G2 肝癌細胞株卻無此現(xiàn)象。因此5-Aza-Cd R 可增強對化療藥物的敏感性（如順鉑）誘導肝癌細胞的凋亡。此外，Venturelli 等［20］研究指出，5-氮雜胞苷具有雙重抗腫瘤的作用，即既可恢復惡性腫瘤相關(guān)表型的表觀遺傳狀態(tài)，又可使腫瘤對凋亡誘導物質(zhì)［如腫瘤壞死因子相關(guān)誘導凋亡配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）］進行有效的復敏。另一種非競爭性非核苷酸類甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑如普魯卡因酰胺，作用機制可能是通過影響酶的活性使胞嘧啶殘基甲基化受阻，而非直接聚合到DNA鏈，臨床試驗研究結(jié)果顯示普魯卡因酰胺不良反應小，具有臨床靶向生物治療腫瘤的潛力［21］。這些研究說明DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑不失為肝癌化療的一種手段，對其應用價值的進一步探討將會對肝細胞癌的綜合治療起到重要的推動作用。

4 展 望

近來肝癌表觀遺傳學的研究進展迅速，多種基因的甲基化與肝癌的早期診斷、療效觀察及預后判斷等臨床關(guān)系已逐漸明確，但肝癌的發(fā)生是多因素參與的復雜過程，仍有諸多問題尚待研究，如DNA甲基化及組蛋白乙酰化、甲基化和磷酸化與肝癌的關(guān)系、甲基化與染色體重構(gòu)的關(guān)系等。此外，雖然DNA甲基化抑制劑在臨床試驗中顯示出良好的前景，但藥物使用的種類、途徑及時間等還不夠成熟，在療效和不良反應方面還不令人滿意。因此，在臨床上需要選擇特異性更強，敏感性更高的甲基化基因應用于肝癌患者，實現(xiàn)肝癌的分子靶向治療。

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