水稻S5-ORF3蛋白質(zhì)的進(jìn)化分析

張達(dá)瀚，張 屹

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.河北科技大學(xué)理學(xué)院，河北石家莊 050018)

水稻S5-ORF3蛋白質(zhì)的進(jìn)化分析

張達(dá)瀚1，張 屹2

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.河北科技大學(xué)理學(xué)院，河北石家莊 050018)

生殖隔離在形成新物種和物種同一性的保持中有重要作用，因而在水稻優(yōu)化育種中有重要的意義。S5位點(diǎn)是一個(gè)已克隆的控制水稻生殖隔離的基因，它產(chǎn)生的S5-ORF3，ORF4和ORF5蛋白質(zhì)共同調(diào)控著indica-japonica雜交后代的育性，特別是S5-ORF3蛋白質(zhì)在打破水稻亞種indica-japonica之間的生殖隔離與促進(jìn)物種間的基因交流中發(fā)揮重要作用。針對(duì)S5-ORF3的進(jìn)化分析對(duì)于研究它的功能和起源很重要，但目前尚無報(bào)道。本文基于序列和進(jìn)化分析，提出S5-ORF3為一種定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的新的HSP70家族蛋白，但缺乏HSP70的C端的多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域，推測(cè)S5-ORF3可能通過影響alpha-淀粉酶的合成來作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力；找到了ORF3的19條同源蛋白，并用極大似然算法構(gòu)建了可靠的進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)水稻的S5-ORF3與節(jié)節(jié)麥的luminal-binding蛋白進(jìn)化關(guān)系最為密切；作了置信度100%的S5-ORF3蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)了居中的配體綁定位點(diǎn)；發(fā)現(xiàn)了水稻的S5-ORF3與其他HSP70蛋白相比獨(dú)特的基序，為進(jìn)一步研究S5-ORF3的作用機(jī)理和演化歷史提供了線索和數(shù)據(jù)支持。

水稻；S5-ORF3 蛋白；進(jìn)化樹；正向選擇；配體結(jié)合

生殖隔離限制了物種間的基因交流，一般來說，水稻的2個(gè)亞種indica和japonica間產(chǎn)生的后代是不育的[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，在水稻基因組的S5位點(diǎn)有一個(gè)與生殖隔離相關(guān)的“破壞與保護(hù)蛋白系統(tǒng)”，該系統(tǒng)由3個(gè)緊密連鎖的基因ORF3，ORF4，ORF5組成，這三者共同調(diào)控著indica-japonica雜交后代的育性，ORF4+與ORF5+導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力，這種壓力導(dǎo)致雜交水稻雌配子敗育，而ORF3+作為保護(hù)者又會(huì)阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的產(chǎn)生，從而抑制雌配子敗育并打破生殖隔離，使indica和japonica之間的基因可以交流[3]。研究發(fā)現(xiàn)S5-ORF3與HSP70有一定的同源性。本研究希望知道哪些蛋白與ORF3同源，它們的進(jìn)化關(guān)系如何；水稻的S5-ORF3有哪些正向選擇位點(diǎn)一直伴隨和影響著這組蛋白質(zhì)從古至今的功能變化；水稻的S5-ORF3蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和與配體的結(jié)合位點(diǎn)是怎樣的等等，這些對(duì)于進(jìn)一步理解這個(gè)關(guān)鍵的蛋白質(zhì)有重要的意義。本研究重點(diǎn)進(jìn)行S5-ORF3的進(jìn)化分析，為進(jìn)一步理解水稻生殖隔離和基因交流提供線索和數(shù)據(jù)支持。

植物的HSP70是由多個(gè)基因家族編碼的。HSP70家族按表達(dá)情況可分為HSC70 (heat shock cognate protein 70)和 HSP70兩大類。HSC70在所有細(xì)胞內(nèi)都能表達(dá)，同時(shí)也受一定程度的熱誘導(dǎo)，是結(jié)構(gòu)型HSP；HSP70在正常情況下表達(dá)很少或不表達(dá)，而在熱刺激或其他脅迫下表達(dá)迅速增強(qiáng)，屬于誘導(dǎo)型的HSP。根據(jù)它在植物中的亞細(xì)胞定位的位置，HSP70可分為4個(gè)亞族[4]：1)C端含有EEVD基序的HSP70，定位于細(xì)胞質(zhì)中；2)含HDEL基序的HSP70，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，也稱BiP蛋白；3)含PEAEYEEAKK的HSP70，定位于線粒體中；4)含PECDVLDADFTDSK的HSP70，定位于質(zhì)體中?？傮w來說，HSP70易于存在于細(xì)胞器中。但是水稻的S5-ORF3蛋白質(zhì)中沒有這幾種基序(motif)，只含有一個(gè)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的HSP70相似的基序HDLL。從嚴(yán)格意義上說，水稻的S5-ORF3是一種新的HSP70。

與S5-ORF3最相近的這種定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的HSP70，即BiP蛋白，全名叫 the luminal binding protein, 是一種分子伴侶。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力情況下，BiP的過表達(dá)有助于alpha-淀粉酶[5]的合成。但目前S5-ORF3的熱激誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)還沒有做過，不能斷定它是否為一種HSC70，也不能斷定S5-ORF3緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的機(jī)制是否也與alpha-淀粉酶的合成有關(guān)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)

水稻的 S5-ORF3 蛋白質(zhì)有4 條：JX138498—JX138501，可從NCBI上下載得到。選擇indicagroup cultivar Nanjing 11 為 Query Sequence，通過blastp (protein-protein blast) 方法，從NCBI上執(zhí)行同源搜索而得到100條蛋白質(zhì)序列(數(shù)據(jù)庫更新至2014-01-25)。由于hypothetical protein與predicted protein，partial protein以及putative protein不能保證蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確性和完整性，所以舍去在說明行中含有partial，hypothetical, predicted，candidate division，uncluture，putative單詞的序列，同時(shí)也舍去沒有明確說明所屬物種的序列。然后，在余下的序列中為每個(gè)物種保留一條ident值最高的序列。最終，得到S5-ORF3的19條同源序列。加上水稻的S5-ORF3蛋白質(zhì)4條，此次蛋白質(zhì)進(jìn)化分析所用的蛋白質(zhì)序列共23條，它們所對(duì)應(yīng)的物種名字及Gene Bank ID如下所示：

japonicagroup cultivar balilla 水稻培育品種balilla: gi|406066535

indicagroup cultivar Nanjing 11 水稻培育品種南京11號(hào): gi|406066539

cultivar02428 水稻培育品種02428: gi|406066554

cultivardular 水稻培育品種dular: gi|406066557

aegilopstauschii節(jié)節(jié)麥: gi|475588157

populustrichocarpa毛果楊: gi|566196410

glycinemax大豆: gi|2642238

ricinuscommunis蓖麻: gi|255555659

solanumlycopersicum番茄: gi|350539203

hordeumvulgaresubsp.vulgare大麥: gi|476003

triticumurartu烏拉爾圖小麥: gi|474200923

theobromacacao可可: gi|508777841

cyanophoraparadoxa藍(lán)載藻: gi|255977229

capsicumsp. JYM-2013 辣椒: gi|528746217

nicotianatabacum煙草: gi|729623

gossypiumhirsutum陸地棉: gi|211906506

cucumissativus黃瓜: gi|6911549

arabidopsisthaliana擬南芥: gi|15241844

vitisvinifera葡萄: gi|297742397

zeamays玉米: gi|162457723

maluspumila蘋果: gi|57639078

pseudotsugamenziesii花旗松: gi|7635897

spinaciaoleracea菠菜: gi|3913786

1.2方法

S5-ORF3的同源蛋白搜索用blastp (protein-protein blast)方法，進(jìn)化樹的繪制用 Mega5[6]的Max-likelihood方法，保守motif的發(fā)現(xiàn)用MEME[7]，正向選擇位點(diǎn)用Mrbayes 3.1.2[8]計(jì)算，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與配體搜索用網(wǎng)上軟件Phyre2[9]和3DligandSite[10]執(zhí)行。圖1示出了水稻4條S5-ORF3蛋白質(zhì)與其19條同源蛋白序列的聯(lián)配情況。

圖1 4條S5-ORF3蛋白質(zhì)與其19條同源蛋白序列的聯(lián)配Fig.1 Alignment of 4 S5-ORF3 proteins and its 19 homologous sequences

A—HSP 70的結(jié)構(gòu)示意圖，KD為蛋白質(zhì)質(zhì)量單位，千道爾頓；B—23條序列的聯(lián)配圖，其中，水稻的4條ORF3序列(JX138498—JX138501)在最上方，其下面緊挨著的是節(jié)節(jié)麥的同源序列，它們與其他序列(包括HSP 70)相比，明顯缺乏后面的C-端區(qū)域；C—S5-ORF3蛋白質(zhì)及其同源序列中置信度最高的3個(gè)基序(motif)，其中第3個(gè)motif“TTYS…”motif在水稻的S5-ORF3與藍(lán)載藻Bip蛋白中沒有，另外2種motif則是所有序列所共有的

2 結(jié)果與討論

用Nanjing 11 S5-3(indicagroup cultivar Nanjing 11 gene的產(chǎn)物)在NCBI中用blastp進(jìn)行搜索，找到19條有代表性的同源序列，發(fā)現(xiàn)ORF3的產(chǎn)物蛋白質(zhì)主要與Luminal-binding protein和HSP70在進(jìn)化上相關(guān)。

2.1與HSP70蛋白質(zhì)的相關(guān)性分析

植物的HSP 70也與植物的脅迫應(yīng)答機(jī)制、分子伴侶的作用及抗逆性的提高有密切關(guān)聯(lián)[11]，整體來說(見圖1 A)，包括N端保守域和C端區(qū)域2個(gè)部分。ORF3在blastp搜索中，局部結(jié)構(gòu)域展現(xiàn)了與HSP 70的高度相關(guān)性，如圖1 B 所示，ORF3與HSP 70蛋白的N端出現(xiàn)了大段的連配區(qū)域，說明ORF3有ATPase相似的結(jié)構(gòu)域，但缺乏HSP 70后面的C端區(qū)域。圖1 B 最上面的4條序列是水稻的S5-ORF3序列：JX138498—JX138501，發(fā)現(xiàn)在聯(lián)配圖中，“AIAIPRAAPA”為S5-ORF3所特有，而它的同源蛋白質(zhì)沒有氨基酸區(qū)域；其他序列所擁有的從“VIPAKKSQTFTTYQDQQTTVTI…”開始的蛋白質(zhì)區(qū)域也是S5-ORF3蛋白質(zhì)所沒有的。筆者推測(cè)，這2個(gè)片段在決定S5-ORF3與luminal-binding蛋白和HSP 70蛋白在結(jié)構(gòu)和功能差異上發(fā)揮重要作用。

2.2與luminal-binding蛋白質(zhì)的相關(guān)性分析

這23條序列的blast聯(lián)配結(jié)果(見圖1 B)顯示，水稻的S5-ORF3與gi|475590630|gb|EMT21528.1| luminal-binding protein 2 [aegilopstauschii] (節(jié)節(jié)麥)、gi|255977229|dbj|BAH97106.1| luminal binding protein BipCyanophoraparadoxa(早期散發(fā)藻類藍(lán)載藻)最為相似，也就是說它與luminal-binding蛋白質(zhì)的相似程度最大。luminal-binding 蛋白緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，增強(qiáng)煙草和大豆對(duì)于旱災(zāi)的抗逆性[5，12-13]，而S5-ORF3所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也有緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的功能[3]，所以，推斷它與luminal-binding 的共同結(jié)構(gòu)域?qū)τ诰徑鈨?nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力是至關(guān)重要的。

2.3在水稻S5-ORF3蛋白質(zhì)及其同源序列中尋找保守基序和正向選擇位點(diǎn)

為了在S5-ORF3蛋白質(zhì)及其同源序列中尋找保守的基序(motif)，筆者應(yīng)用了MEME suite[7]，并且把發(fā)現(xiàn)的前3個(gè)得分最高的motif展示在圖1 C中。這些motif的生物學(xué)功能有待進(jìn)一步研究。在圖1 C中從上到下，第1個(gè)motif的正則表達(dá)式為RALSSQHQVRVEIESLFDG[VT]DFSEPLTRARFEELNNDLFRKTMGPVKKAM，E值為7.8×10-734，在所有序列中都存在；第2個(gè)motif的正則表達(dá)式為KNILVFDLGGGTFDVSILTIDNGVFEVL[AS]TNGDTHLGGEDFD[QH]R[IV]M[ED]YFI，E值為4.0×10-724，是在所有序列中都有的；第3個(gè)motif的正則表達(dá)式為TTYSCVGVYKNGHVEIIANDQGNRITPSWVAFTD[SG]ERLIGEAAKNQAAVN，E值為3.0×10-720，在水稻的S5-ORF3與藍(lán)載藻中沒有第3個(gè)motif。

在S5-ORF3及其同源體的進(jìn)化歷史中，每個(gè)氨基酸或密碼子都是一個(gè)位點(diǎn)。有許多位點(diǎn)是保守的，因?yàn)樗鼈儞?dān)負(fù)著重要的結(jié)構(gòu)和功能，若變化就會(huì)導(dǎo)致個(gè)體死亡；有的則只進(jìn)行著中性的漂變，密碼子只作同義變化；還有一些位置則擔(dān)負(fù)起功能進(jìn)化的角色，隨著歲月的流逝、物種的進(jìn)化，它們通過適當(dāng)?shù)耐x和異義的突變使蛋白質(zhì)和個(gè)體更能適應(yīng)環(huán)境與條件，這些密碼子為“正向選擇位點(diǎn)”。但是，通過MrBayes3.1.2[8]軟件的計(jì)算，并沒有發(fā)現(xiàn)S5-ORF3的正向選擇位點(diǎn)，因?yàn)槲稽c(diǎn)的最大正向選擇概率僅為0.132 5，這是不顯著的。缺乏正向選擇位點(diǎn)應(yīng)該與HSP70家族蛋白質(zhì)的保守性有關(guān)。

2.4水稻的4條S5-ORF3蛋白質(zhì)與其19條同源序列所做的進(jìn)化樹

用Mega5中的ML算法構(gòu)建進(jìn)化樹并且用bootstrap 500次以檢查分枝的置信度。如圖2所示，S5-ORF3在包括藻類在內(nèi)的很多植物中都有同源體，水稻的S5-ORF3蛋白質(zhì)序列與節(jié)節(jié)麥和藍(lán)載藻的luminal-binding 蛋白有非常緊密的親緣關(guān)系。該進(jìn)化樹的根部分支的bootstrap置信度很高，從而是可靠的。從進(jìn)化樹上看，與ORF3同源的蛋白質(zhì)序列整體上可分為2組，一組是由節(jié)節(jié)麥的luminal-binding 蛋白與水稻的S5-ORF3組成的，而HSP70與其他物種的luminal-binding蛋白組成另外一組。從連配圖(見圖1 B)中可見，這2組序列的最大差異在于它們的C端結(jié)構(gòu)域的有無。

圖2 S5-ORF3與19條同源序列的進(jìn)化樹及Nanjing 11 S5-ORF3蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和配體位置圖 Fig.2 Evolutionary tree of S5-ORF3 as well as 19 homologous sequences, and the protein structure and the ligand site of Nanjing 11 S5-ORF3

很明顯，水稻的4條S5-ORF3蛋白質(zhì)序列與節(jié)節(jié)麥和藍(lán)載藻的luminal-binding 蛋白有非常緊密的親緣關(guān)系。其中，結(jié)構(gòu)圖由網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器Phyre2 預(yù)測(cè)產(chǎn)生。PDB庫中的模板為c3d2fc，這個(gè)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可信度100%。N端為紅色，C端為紫色。3DligandSite作了配體綁定位點(diǎn)預(yù)測(cè)，Nanjing 11 S5-ORF3的蛋白質(zhì)中部有18個(gè)可能的配體結(jié)合位點(diǎn)。

2.5水稻S5-ORF3蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及可能配體結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器Phyre2[9]來預(yù)測(cè)S5-ORF3 Nanjing 11的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。因?yàn)镹anjing 11是典型的ORF3+序列，這個(gè)序列對(duì)于ORF4和ORF5有顯著的上位效應(yīng)。該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)(如圖2的左上方“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)圖”所示)由15個(gè)alpha螺旋、18個(gè)beta片和一些coil組成。整體來說，該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來源于sse1p和HSP 70的組合，對(duì)于PDB庫中的模板c3d2fc的覆蓋度為83%，模型預(yù)測(cè)可信度100%，這應(yīng)該是得益于HSP70家族的蛋白質(zhì)保守性很強(qiáng)。此外，發(fā)現(xiàn)在S5-ORF3的中部有一個(gè)空洞，有可能是配體的結(jié)合位置。另外，預(yù)測(cè)了S5-ORF4的三維結(jié)構(gòu)，是2個(gè)巨大的alpha螺旋被一條細(xì)小的coil所連接。為了進(jìn)一步研究S5-ORF3的配體結(jié)合的性質(zhì)，把用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器Phyre2預(yù)測(cè)得到的S5-ORF3結(jié)構(gòu)的PDB原子坐標(biāo)文件輸入配體結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件，3D ligandSite[10]來預(yù)測(cè)ORF3可能的配體結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)軟件是依據(jù)結(jié)構(gòu)的相似性來預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的，適用于這種保守性很強(qiáng)的蛋白質(zhì)的配體結(jié)合點(diǎn)的預(yù)測(cè)工作。預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2右下方的“配體位置圖”所示，該配體位于S5-ORF3蛋白質(zhì)的中部。預(yù)測(cè)得到的可能的18個(gè)配體綁定位點(diǎn)為68HIS, 70GLY,71ASN, 72THR, 73ASN, 260HIS, 262GLY, 263GLY, 264ARG, 291GLY, 292ASP, 329GLU, 332LYS, 333LYS, 336SER, 400GLY, 401SER, 403ARG。

3 結(jié) 語

S5-ORF3的熱激表達(dá)效應(yīng)、緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的機(jī)制是否也與alpha-淀粉酶的合成有關(guān)，它中部的配體是什么，S5位點(diǎn)中其他的調(diào)控雜交不育的因素，如非編碼RNA 及其可能所引發(fā)的的上位效應(yīng)等[14-16]，仍需要做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

致 謝：感謝華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張啟發(fā)院士和歐陽亦聃副研究員的熱情幫助。

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Evolution analysis of rice protein S5-ORF3

ZHANG Dahan1, ZHANG Yi2

(1. College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan Hubei 430070, China; 2.School of Science, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang Hebei 050018, China)

Reproductive isolation is important in speciation and maintaining species identity, so it is very significant in optimization of breeding rice. S5 locus is a cloned gene controlling the reproductive isolation, which produces proteins S5-ORF3, ORF4 and ORF5 that work together to regulate fertility in indica-japonica hybrids, and especially the S5-ORF3 protein plays a very important role in distorting reproductive isolation among indica-japonica and enhancing gene flow among populations. The evolutionary analysis of S5-ORF3 is significant for studying its function and origin, which is still no reported. In this paper, based on sequence and evolution analysis, it is proposed that the S5-ORF3 is a new HSP70 family protein which is located in endoplasmic reticulum (ER) and lacks of multi-peptide binding domain. Evolution analysis suggests that S5-ORF3 might act on ER stress via affecting alpha-amylase synthesis; moreover, 19 homologous proteins of S5-ORF3 are found, ML phylogenetic tree is constructed, and it is found that there is close evolution relationship between rice S5-ORF3 and a luminal-binding protein of Aegilops tauschii; the 3D structure of S5-ORF3 with confidence of 100% is predicted, as well as a ligand-binding site located in the middle of S5-ORF3. The specific motif of rice S5-ORF3 among HSP70 family is also found. This work may provide some clues and data for studying function and evolution history of rice S5-ORF3.

rice; protein S5-ORF3; phylogenetic tree; positive selection; ligand-binding

2014-04-04；

2014-05-06；責(zé)任編輯：張士瑩

國家自然科學(xué)基金(J1103510,11171088);教育部重點(diǎn)項(xiàng)目(212011)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2014BC020)；河北省自然科學(xué)基金(A2011208002)

張達(dá)瀚(1996-)，男，河北石家莊人，主要從事植物生物學(xué)方面的研究。

張 屹教授，博士。E-mail:zhaqi1972@163.com

1008-1542(2014)04-0397-06

10.7535/hbkd.2014yx04015

Q816

A

張達(dá)瀚，張 屹.水稻S5-ORF3蛋白質(zhì)的進(jìn)化分析[J].河北科技大學(xué)學(xué)報(bào),2014,35(4):397-403.

ZHANG Dahan, ZHANG Yi.Evolution analysis of rice protein S5-ORF3[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2014,35(4):397-403.