王東彬 黎瑋 楊書文 瞿長寶 喬娜 蔡文清

·論著·

腎上腺髓質素對腎腫瘤細胞PI3K/Akt/eNOS/VEGF信號通路的作用

王東彬 黎瑋 楊書文 瞿長寶 喬娜 蔡文清

目的研究腎上腺髓質素(ADM)對腎腫瘤細胞磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/內皮型一氧化氮合酶(eNOS)/血管內皮生長因子(VEGF)信號通路的影響。方法將腎腫瘤細胞分為對照組、ADM組、VEGF組，ADM+VEGF受體抑制劑組，ADM+ADM shRNA組,每組設置24 h、48 h、72 h 3個時間梯度,western-blot檢測對照組和ADM組細胞總蛋白中PI3K、Akt、eNOS、VEGF表達;檢測VEGF組，ADM+VEGF受體抑制劑組和ADM+ADM shRNA組細胞總蛋白中PI3K、Akt、eNOS的表達。結果PI3K、Akt、eNOS、VEGF在ADM組各時間梯度組腎腫瘤細胞中表達明顯高于其在對照組細胞的表達(P<0.05)。PI3K、Akt、eNOS在VEGF組和ADM+VEGF受體抑制劑組各時間組腎腫瘤細胞中表達明顯高于其在對照組細胞中表達(P<0.05)。PI3K 、Akt 、eNOS在ADM+ ADM shRNA組各時間組腎腫瘤細胞中表達與其在對照組細胞中表達差異無統計學意義(P>0.05)。結論ADM可激活PI3K/Akt/eNOS/VEGF信號通路；VEGF受體抑制劑不能阻斷ADM 激活PI3K/Akt/eNOS信號通路。ADM一方面通過VEGF發(fā)揮腎腫瘤血管生成作用，另一方面通過其受體激活PI3K/Akt/eNOS信號通路參與腎腫瘤血管生成作用。ADM可能成為抗血管治療腎腫瘤新的靶點。

腎上腺髓質素；血管內皮生長因子；磷脂酰肌醇-3激酶；蛋白激酶B；內皮型一氧化氮合酶；腎腫瘤

抗VEGF治療已經成為治療進展期腎細胞癌最有效的治療策略,已有多種藥物應用于臨床,但部分患者治療效果不滿意，表明在已知治療靶點外，還存在其他血管生成因素。腎上腺髓質素(ADM)有希望成為下一個抗血管生成治療腎細胞癌的靶點。本實驗目的為明確ADM在腎細胞癌血管生成信號通路的作用以及此作用與血管內皮生長因子(VEGF)的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人腎癌786-0細胞由北京協和大學基礎研究所提供。

1.2 主要試劑 ADM純品和山羊抗兔二抗購于北京博奧森公司,兔抗人eNOS抗體購于美國ABCam公司。ADMshRNA，VEGF純品，VEGF受體抑制劑，兔抗人Akt抗體，兔抗人PI3K抗體和小鼠抗人VEGF抗體購于美國santa cruz公司，RPMI1640細胞培養(yǎng)干粉購于美國Gibcobrl公司，胎牛血清購于北京華美公司，考馬斯亮蘭蛋白定量盒由上?？婆d生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器 BIX-311二氧化碳培養(yǎng)箱，DG-3A電泳槽，DYY-Ⅲ7B 型轉移電泳儀，UVP凝膠成相分析系統。

1.4 分組 取對數生長期，生長良好的786-0細胞分為對照組、ADM組(100 μmol/L)、VEGF組(50 μmol/L)、ADM+VEGF受體抑制劑組(ADM:100 μmol/L，VEGF受體抑制劑：100 μmol/L)、ADM+ADM shRNA組(ADM:100 μmol/L，ADM+ADM shRNA：1 μmol/L)。每組設24、48、72 h 3個時間點。5組細胞置于RPMI1640培養(yǎng)基，在含5%二氧化碳的飽和濕度的37℃孵箱中培養(yǎng)后收獲細胞。

1.5 測定蛋白濃度 培養(yǎng)瓶內加入裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心20 min，吸上清至一個新的清潔EP管中，采用考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒，測定上清液蛋白濃度。

1.6 Western-blot檢測各組細胞總蛋白中磷脂酰肌醇(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、VEGF的表達 每組取20 μg蛋白，裂解液補齊容量，沸水浸泡5 min。大齒梳最多可上50 μl，10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)120 V電壓下分離后轉膜(PI3K：90 V、60 min；Akt：90 V、50 min；eNOS：120 V、150 min；VEGF：30 V、30 min)。5%脫脂奶粉漿膜封閉2 h后加入一抗(β-actin 1∶1 000，Akt 1∶1 000，PI3K 1∶1 000，eNOS 1∶1 000，VEGF 1∶400)，室溫孵育1.5 h,TBST充分漂洗后加入辣根酶標記的二抗(山羊抗兔二抗，抗體稀釋濃度1∶7 500)，孵育1.5 h，TBST再次充分漂洗，最后用ECL顯色試劑顯色。應用圖像分析軟件Bandscan(Glyko公司)對顯色條帶進行灰度分析。

1.7 結果判定 凝膠成像系統(UVP,美國)LabWorks 4.5軟件對蛋白表達行半定量分析，以積分吸度(IOD)值表示。

2 結果

2.1 PI3K在5組腎腫瘤細胞中的表達 Western bolt檢測PI3K在ADM處理組3個時間組腎腫瘤細胞中表達明顯高于其在對照組腎腫瘤細胞中表達(P<0.05)。在VEGF處理組3個時間組腎腫瘤細胞中表達明顯高于其在對照組腎腫瘤細胞中表達(P<0.05)。在ADM+VEGF受體抑制劑組3個時間組腎腫瘤細胞中表達明顯高于其在對照組腎腫瘤細胞中表達(P<0.05)。PI3K在ADM+ADM shRNA組3個時間組表達與對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

組別24h48h72h對照組0．7987±0．03700．7928±0．04600．7986±0．0629ADM組0．9342±0．0431?1．0328±0．0495?1．3503±0．0503?VEGF組0．8939±0．0922?1．0213±0．0481?1．3890±0．0394?ADM+ADMshRNA組0．7399±0．0530#0．7885±0．06140．8032±0．0593ADM+VEGF受體抑制劑0．9122±0．0860?1．0276±0．0665?1．3466±0．0454?

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 AKT在5組腎腫瘤細胞中的表達 Western bolt檢測AKT在ADM處理組3個時間點腎腫瘤細胞中表達明顯高于其在對照組腎腫瘤細胞中表達(P<0.05)。在VEGF處理組3個時間點腎腫瘤細胞中表達明顯高于其在對照組腎腫瘤細胞中表達(P<0.05)。在ADM+VEGF受體抑制劑組3個時間組腎腫瘤細胞中表達明顯高于其在對照組腎腫瘤細胞中表達(P<0.05)。AKT在ADM+ADM shRNA組3個時間點表達與對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

組別24h48h72h對照組0．7461±0．05310．7411±0．07760．7504±0．0724ADM組0．8365±0．0671?0．9729±0．0593?1．0530±0．0432?VEGF組0．8481±0．0661?0．9749±0．0979?1．0433±0．0551?ADM+ADMshRNA組0．7423±0．0748#0．7462±0．07510．7372±0．0715ADM+VEGF受體抑制劑0．8237±0．0452?0．9509±0．0318?1．0352±0．0407?

注：與對照組比較，*P<0.05

2.3 eNOS在5組腎腫瘤細胞中的表達 Western bolt檢測eNOS在ADM處理組3個時間組腎腫瘤細胞中表達明顯高于其在對照組腎腫瘤細胞中表達(P<0.05)。在VEGF處理組3個時間組腎腫瘤細胞中表達明顯高于其在對照組腎腫瘤細胞中表達(P<0.05)。在ADM+VEGF受體抑制劑組3個時間組腎腫瘤細胞中表達明顯高于其在對照組腎腫瘤細胞中表達(P<0.05)。eNOS在ADM+ADM shRNA組3個時間組表達與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

組別24h48h72h對照組0．8613±0．04420．8692±0．06400．8778±0．0568ADM組1．1875±0．0627?1．3415±0．0583?1．4069±0．0337?VEGF組1．1990±0．0723?1．3371±0．0533?1．4140±0．0598?ADM+ADMshRNA組0．8083±0．07480．8071±0．03660．8288±0．0921ADM+VEGF受體抑制劑1．1880±0．0654?1．3311±0．0503?1．4129±0．0384?

注：與對照組比較，*P<0.05

2.4 VEGF在ADM處理組和對照組中的表達 Western bolt檢測VEGF在ADM處理組24、48、72 h 3個時間組腎腫瘤細胞中表達明顯高于其在對照組腎腫瘤細胞中表達(P<0.05)。VEGF在ADM+ADM shRNA組3個時間組表達與對照組，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

組別24h48h72h對照組0．7647±0．05710．7713±0．06320．7746±0．0512ADM組0．8717±0．0943?1．4345±0．0927?1．7579±0．0721?ADM+ADMshRNA組0．7363±0．07930．7700±0．06780．7856±0．0784

注：與對照組比較，*P<0.05

3 討論

腎細胞癌為典型多血管腫瘤，依賴于腫瘤新生血管生成滿足其生長和進展過程中對營養(yǎng)物質的需求量不斷增加和帶走代謝廢物，維持內環(huán)境穩(wěn)定。抗血管生成是治療腎腫瘤有效策略。已經有多種抗血管生成藥物應用于腎細胞癌的治療，并且取得令人滿意的效果，這些藥物主要是抗VEGF藥物。ADM和VEGF一樣在人正常組織和腫瘤組織中廣泛表達[1]，已經證實ADM作為腫瘤細胞自分泌和旁分泌因子促進腫瘤細胞的生長和進展，還促進周圍內皮細胞增殖和改變血管的通透性促進腫瘤遠處轉移[2]。ADM在腎細胞癌生成和進展方面同樣具有促進作用，ADM在體外低氧環(huán)境培養(yǎng)的腎腫瘤細胞中表達升高[3];ADM作用于腎腫瘤細胞可誘導VEGF mRNA表達明顯升高，ADMR shRNA可抑制ADM這一作用[4];ADM和ADMR在腎細胞癌組織中表達明顯高于其在正常腎組織中表達,并且ADM和ADMR高表達與腫瘤組織中微血管密度成正相關性[5]。以上研究表明產生和分泌ADM為腎腫瘤細胞自身保護機制,和腫瘤血管生成有關。

VEGF是目前發(fā)現最強大的血管生成誘導劑，通過激活各種信號轉導通路促腫瘤血管生成，阻斷與VEGF有關的信號通路可達到治療腫瘤的作用。PI3K/AKT/eNOS與腫瘤進展 至關重要，如PI3K/AKT在卵巢上皮癌組織中表達與腫瘤臨床分期、細胞組織學分化有顯著相關性[6，7]。其在腫瘤血管生成方面的作用也得到共識，活化的AKT 可使eNOS磷酸化使之激活，產生NO，NO 與血管生成密切相關[8];PI3K/Akt 還可激活激酶HDM2調控VEGF和缺氧誘導因子1α的表達[9]，促進細胞對VEGF 及其他血管生成因子的表達和分泌；VEGF可反饋性活化PI3K/AKT 信號通路，從而進一步刺激血管生成;抑制PI3K/AKT/eNOS通路，可抑制VEGF的促內皮細胞增殖，遷移和增加血管通透性的作用[10]。本研究結果發(fā)現ADM可激活人腎腫瘤細胞內PI3K/AKT/eNOS/VEGF信號通路；VEGF可激活腎腫瘤細胞內PI3K/AKT/eNOS通路。ADM作用于腎腫瘤細胞可誘導VEGF mRNA表達明顯升高[4]，表明ADM可能通過影響VEGF發(fā)揮PI3K/AKT/eNOS通路激活作用。本實驗結果還發(fā)現VEGF受體抑制劑阻斷VEGF的作用后，ADM仍可激活PI3K/AKT/eNOS通路；而通過記憶靜默技術，抑制ADM的作用后，PI3K/AKT/eNOS信號通路活性受到抑制。表明ADM還可以通過其受體直接激活PI3K/AKT/eNOS參與腎腫瘤血管生成。

綜上所述，ADM具有腎腫瘤血管生成作用，有助于腎腫瘤的發(fā)生和進展，ADM一方面通過影響VEGF參與腎腫瘤血管生成的調節(jié)，同時ADM還通過其自身受體，激活PI3K/AKT/eNOS通路，參與血管生成的調節(jié)。但ADM這一作用尚未在活體實驗證實，ADM可能成為新的治療腎腫瘤的靶點。

1 Kitamura K,Sakata J,Kangawa K，et al.Cloning and characterization of cDNA encoding a precursor for human adrenomedullin.Biochem Biophys Res Commun,1993,194:720-725.

2 Cuttitta F,Pio R,Garayoa M,et al.Adrenomedullin functions as an important tumor survival factor in human carcinogenesis.Microsc Res Tech,2002,57:110-119.

3 王東彬，黎瑋，楊書文，等.低氧刺激對腎腫瘤細胞ADM基因表達的影響及意義.山東醫(yī)藥，2012，52:59-69.

4 敦雙華，王東彬，喬娜，等.VEGF在腎癌細胞的表達及腎上腺髓質素對其影響.山東醫(yī)藥，2012，52：36-37.

5 王東彬，蔡文清，楊樹文，等.腎上腺髓質素在腎腫瘤組織中的表達及其與腫瘤組織微血管密度的關系.中華實驗外科雜志，2011,28：854-856.

6 尚素霜，程佳，張靜，等.卵巢上皮癌中HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K的表達及臨床意義.河北醫(yī)藥,2012，34:2256-2259.

7 程佳，楊曉龍，尚素霜，等.卵巢上皮性癌組織中磷酸化蛋白激酶B的表達及意義.河北醫(yī)藥,2013,35:1797-1799.

8 Gordan JD，Simon MC.Hypoxia-inducible factors: central regulators of the tumor phenotype.Curr Opin Genet Dev，2007，17:71-77．

9 Jiang BH，Liu LI.AKT signaling in regulating angiogenesis.Curr Cancer Drug Targets，2008，8:19-26．

10 Bhattacharya D,Singh MK,Chaudhuri S,et al.T11TS impedes glioma ngiogenesis by inhibiting VEGF signaling and pro-survival I3K/Akt/eNOS pathway with concomitant upregulation of PTEN in brain endothelial cells.J Neurooncol,2013,113:13-25.

EffectoftheadrenomedullinonthesignalingpathwayofPI3K/Akt/eNOS/VEGFinrenaltumorcell

WANGDongbin,LIWei,YANGShuwen,etal.

DepartmentofUrology,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

ObjectiveTo investigate the effect of the adrenomedullin on the signaling pathway of PI3K/Akt/eNOS/VEGF in renal tumor cell.MethodsThe kidney tumor cells were divided into five groups,control group,ADM group,VEGF group,ADM+VEGF receptor inhibitor group,ADM+ADM shRNA group,moreover,every group was redivided three time gradient groups (24 hours,48 hours and 72 hours).The expression levels of PI3K,Akt,eNOS,VEGF in control group and ADM group and the expression levels of PI3K,Akt,eNOS in VEGF group,ADM+VEGF receptor inhibitor group,ADM+ADM shRNA group were detected by Western Blot,respectively.ResultsThe expressions levels of the PI3K,Akt,eNOS,VEGF in ADM groups were significantly higher than those of control group (P<0.05).The expression levels of PI3K,Akt,eNOS in VEGF groups and ADM+VEGF receptor inhibitor groups were significantly higher than those of control group (P<0.05).However there were no significant differences in the expression levels of PI3K,Akt,eNOS between ADM+ ADM shRNA groups and control group (P<0.05).ConclusionADM can activate PI3K/Akt/eNOS signaling pathway in renal tumor cell,which can not be blocked by VEGF receptor inhibitor.On one hand ADM regulates renal tumor angiogenesis by VEGF,on the other hand,by activating PI3K/Akt/eNOS signaling pathway to participate in renal tumor angiogenesis.ADM may become a promising anti-angiogenic target in the treatment of renal tumor.

adrenomedullin;vascular endothelial growth factor;phosphatidylinositol 3-kinase;protein kinase B;endothelial nitric oxide synthase;renal tumor

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.23.001

項目來源：河北省醫(yī)學科學研究重點課題(編號：020130510)；吳階平醫(yī)學基金會臨床科研專項資助基金(編號：320.6750.13250)

050000 石家莊市，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院

R 737.11

A

1002-7386(2014)23-3525-03

2013-11-06)