申葉春 曹巖 蔡艷霞 張凡

·論著·

不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能口腔鱗癌細(xì)胞株的形態(tài)學(xué)分析及流式細(xì)胞周期分析的研究

申葉春 曹巖 蔡艷霞 張凡

目的探討口腔鱗癌不同轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株形態(tài)學(xué)的變化，及對(duì)細(xì)胞周期、凋亡指數(shù)的影響。方法復(fù)蘇傳代口腔鱗癌高、低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株，利用倒置顯微鏡觀察不同細(xì)胞株的形態(tài)學(xué)差異，采用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)兩種不同細(xì)胞株的形態(tài)學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析；利用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)兩種細(xì)胞株中CEA、EMA的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h時(shí)間節(jié)點(diǎn)細(xì)胞周期分布差異。結(jié)果高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株呈梭形外形，粘附性較差，隨傳代時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞異型性更加明顯、且梭形變較突出；低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株呈圓形或卵圓形，細(xì)胞粘附性差，體積較小，細(xì)胞異型性不明顯；高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株CEA、EMA的陽性細(xì)胞比率為(84±7)%和(83±5)%，在低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中的陽性細(xì)胞比率分別為(89±7)%和(81±6)%，兩種指標(biāo)在不同細(xì)胞株中的陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)圖像分析結(jié)果顯示2種細(xì)胞株在細(xì)胞面積、周長(zhǎng)、等效直徑、長(zhǎng)徑、短徑高轉(zhuǎn)移組明顯高于低轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組細(xì)胞株的細(xì)胞變異參數(shù)面積、周長(zhǎng)、等效直徑、長(zhǎng)徑、短徑高轉(zhuǎn)移組明顯低于低轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于低轉(zhuǎn)移組細(xì)胞凋亡指數(shù)(P<0.05)。高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株G1細(xì)胞比值明顯低于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； G2期高低轉(zhuǎn)移組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；S期明顯高于低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的口腔鱗癌細(xì)胞株在形態(tài)學(xué)參數(shù)方面存在一定的差異，這可能是造成其具有不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；口腔鱗癌細(xì)胞株凋亡抑制和細(xì)胞合成期比例優(yōu)勢(shì)是導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)。

口腔鱗癌；細(xì)胞形態(tài)學(xué)；流式細(xì)胞術(shù)；凋亡指數(shù)；免疫細(xì)胞化學(xué)

口腔鱗癌的惡性程度取決于其局部浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的能力，侵襲臨近組織和遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致復(fù)發(fā)、放化療不敏感的主要因素，也是常見死因，而細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和凋亡抑制是導(dǎo)致腫瘤侵襲能力增強(qiáng)、惡性程度增加的原因，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間的關(guān)系少見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞培養(yǎng)、免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)口腔鱗癌不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株的差異，從形態(tài)和分子機(jī)制對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與凋亡關(guān)系進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 口腔鱗癌淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(SCC-LH)、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(SCC-LL)由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部口腔醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。RPMI- 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(lnvin’ogen公司)；新生小牛血清 (杭州四季青生物工程有限公司)；胰蛋白酶A 、青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司)；二甲基亞砜(DMSO) (美國(guó)Sigma公司)；EMA鼠抗人單克隆抗體、CEA鼠抗人單克隆抗體 (北京中杉試劑公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus)；PI粉(美國(guó)Sigma公司);AnnexinV-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 (南京凱基生物)；CO2培養(yǎng)箱 (科俊儀器有限公司)；低溫高速離心機(jī)D-78532(德國(guó) Hettich Zentrifugen 公司) FAC Sort 流式細(xì)胞儀 (美國(guó)BD公司)。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)消毒，紫外照射40 min，培養(yǎng)液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20 min，從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入40℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化，將細(xì)胞懸液移入15 ml離心管，緩慢加入4 ml培養(yǎng)液，離心(1 000 r/min，5 min)，用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 紫外線照射超凈工作臺(tái)30 min，用75%乙醇擦拭雙手，預(yù)熱培養(yǎng)液，兩種細(xì)胞株均在含10%小牛血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 U/ml)雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，溫度37℃、相對(duì)濕度90%、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每隔2～3 d用0.25%胰酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，當(dāng)原貼壁細(xì)胞逐漸趨于圓形，細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間不在連接成片時(shí)為合適消化程度，加入新的培養(yǎng)液停止消化。用彎頭吸管吸取培養(yǎng)液，反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液，吸出適量細(xì)胞懸液分裝到2～3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)液后旋緊瓶蓋，以乙醇棉球擦拭外壁適當(dāng)旋松瓶蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，換液及傳代時(shí)間有細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng) 每張細(xì)胞爬片放入95%乙醇中固定15 min，HE染色，置于40倍顯微鏡下觀察，選擇細(xì)胞密集重疊較少的區(qū)域采圖， 使用CMIAS真彩色病理圖像分析系統(tǒng)采集細(xì)胞涂片的顯微圖像， 然后選擇細(xì)胞分布較均勻、細(xì)胞邊界清晰的視野采集4～10幅400倍圖片,保證有核細(xì)胞200個(gè)以上，對(duì)有核細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分割，輔以手工分割，對(duì)分割出的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行各種形態(tài)學(xué)參數(shù)(面積、周長(zhǎng)、等效直徑、長(zhǎng)徑、短徑、長(zhǎng)短徑比、形狀因子、圓形度、異形指數(shù))自動(dòng)測(cè)量；對(duì)不同細(xì)胞株間的細(xì)胞核、漿的面積、核漿比例、細(xì)胞周長(zhǎng)、平均直徑、圓度、形狀因子進(jìn)行分割，編輯，統(tǒng)計(jì)，獲得細(xì)胞學(xué)變異系數(shù)。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的分布 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min,PBS 洗滌2次，冰乙醇固定,-20℃過夜。取出懸液1 000 r/min離心5 min，棄乙醇固定液，PBS洗滌2次,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，加入PI染液1 ml，4℃孵育60 min，200 目鋼篩過濾。以488 nm 氬離子激光激發(fā),應(yīng)用ModFit LT2.0軟件和CELLQuest 軟件進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測(cè)和分析。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，制成懸液1 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～5)×105/ml，加入500 μl的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入5 μl Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm;發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm。應(yīng)用CELLQuest軟件進(jìn)行凋亡數(shù)據(jù)的分析。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間不同細(xì)胞株的形態(tài)學(xué)觀察 高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株呈梭形排列，粘附性較差，隨傳代時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞異型性更加明顯、且梭形變較突出；低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株呈圓形或卵圓形，細(xì)胞粘附性差，體積較小，細(xì)胞異型性不明顯。見圖1～4。

圖1 高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株傳代培養(yǎng)(12 h)(HE×40)

圖2 高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株傳代培養(yǎng)(36 h)(HE×40)

圖3 低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株傳代培養(yǎng)(12 h)(HE×40)

圖4 低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株傳代培養(yǎng)(36 h)(HE×40)

2.2 CEA、EMA單克隆抗體在傳代細(xì)胞的表達(dá) 傳代細(xì)胞均高比例表達(dá)CEA、EMA，證明細(xì)胞株的傳代培養(yǎng)成功；高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中CEA、EMA的陽性細(xì)胞比率(84±7)%和(83%±5)%，與低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的(89±7)%和(81±6)%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5、6。

圖5 CEA在癌細(xì)胞漿的表達(dá)(HE×100)

圖6 EMA在癌細(xì)胞膜的表達(dá)(HE×100)

2.3 不同細(xì)胞株間細(xì)胞學(xué)形態(tài)參數(shù)和變異系數(shù)的比較 高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株細(xì)胞面積、周長(zhǎng)、等效直徑、長(zhǎng)徑、短徑明顯高于低轉(zhuǎn)移組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；長(zhǎng)短比、形狀因子、圓形度、異形指數(shù)間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的細(xì)胞變異參數(shù)在面積、周長(zhǎng)、等效直徑、長(zhǎng)徑、短徑間明顯高于低轉(zhuǎn)移組組(P<0.05)；長(zhǎng)短比、形狀因子、圓形度、異形指數(shù)間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、2。

表1 不同細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果比較

表1 不同細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果比較

參數(shù)低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株t值P值面積(μm2)28.00±13.18152.02±95.015.99420.001周長(zhǎng)(μm)18.01±3.5835.55±12.8513.99470.000等效直徑(μm)5.56±1.0610.74±3.796.99150.001長(zhǎng)徑(μm)5.90±1.1911.49±4.147.09250.001短徑(μm)5.27±0.9510.05±3.516.82310.002長(zhǎng)短比1.11±0.031.14±0.041.89650.1134形狀因子1.06±0.021.08±0.031.00240.1352圓形度0.94±0.020.92±0.022.25250.6219異形指數(shù)3.64±0.033.69±0.042.45010.4512

2.4 2種細(xì)胞株不同培養(yǎng)時(shí)間的凋亡指數(shù)、細(xì)胞周期分布比較 低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組細(xì)胞凋亡指數(shù)，高于高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株G1期比率明顯低于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(P<0.05)；G2期比率在2組細(xì)胞株間無明顯差異(P>0.05)；S期比率在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株明顯高于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(P<0.05)。見表3，圖7、8。

表2 不同細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)變異系數(shù)比較

表2 不同細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)變異系數(shù)比較

參數(shù)低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株t值P值面積(μm2)0.81±0.471.88±0.819.87620.005周長(zhǎng)(μm)0.29±0.140.77±0.255.77130.000等效直徑(μm)0.28±0.140.74±0.248.99020.001長(zhǎng)徑(μm)0.29±0.140.74±0.224.78140.05短徑(μm)0.28±0.130.73±0.218.90620.001長(zhǎng)短比0.09±0.060.13±0.131.45720.1762形狀因子0.03±0.030.08±0.242.00470.2725圓形度0.03±0.010.08±0.232.13400.2554異形指數(shù)0.02±0.010.06±0.241.63210.3562

表3 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株細(xì)胞周期的分布比較

表3 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株細(xì)胞周期的分布比較

組別G1G2St值P值高轉(zhuǎn)移78.4±5.964.20±0.4517.40±4.25tG1=13.79240.001低轉(zhuǎn)移56.44±4.78 6.40±1.6637.22±5.37tG2=3.42500.2456tS=9.76540.005

圖7 高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移口腔鱗癌細(xì)胞株細(xì)胞周期分布流式曲線

圖8 低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移口腔鱗癌細(xì)胞株細(xì)胞周期分布流式曲線

3 討論

口腔鱗癌是頜面部常見的惡性腫瘤，治療方式以手術(shù)為主的綜合序列治療模式不斷推廣，盡管腫瘤的局部控制率有了顯著提高，但口腔鱗癌患者的5年生存率仍然維持在50%～55%，無明顯改善，主要原因是局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1，2]?？谇击[癌患者在局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等方面存在明顯差異，導(dǎo)致不同的預(yù)后，與腫瘤細(xì)胞自身不同的異質(zhì)性和基因組不穩(wěn)定性密切相關(guān)。腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移始動(dòng)因素與細(xì)胞表面的粘附分子改變以及細(xì)胞形態(tài)變異密切相關(guān)， 兩者協(xié)同作用導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶進(jìn)入間質(zhì)，與間質(zhì)細(xì)胞粘附，侵襲能力增加，同時(shí)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入間質(zhì)或血流后受到多種局部微環(huán)境及機(jī)體免疫促凋亡因素調(diào)控，克服失巢凋亡成為其發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)。Chien等[3]于描述了失巢凋亡這種特殊的凋亡形式，認(rèn)為正常上皮或內(nèi)皮細(xì)胞存在粘附依賴性，其存活依賴于細(xì)胞間和細(xì)胞與基質(zhì)間的信號(hào)傳遞，稱之為錨定依賴。如正常上皮或不具備轉(zhuǎn)移性質(zhì)的實(shí)體瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落進(jìn)入血流后就會(huì)引發(fā)凋亡，稱之為失巢凋亡[3-5]。惡性腫瘤在離開原發(fā)部位后仍能長(zhǎng)時(shí)間保持存活，其抗失巢凋亡的能力的獲得是腫瘤細(xì)胞進(jìn)行侵襲、轉(zhuǎn)移的先決條件。惡性腫瘤的這種抗失巢凋亡的特性已經(jīng)在包括肺癌、大腸癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤的體外細(xì)胞培養(yǎng)中得到證實(shí)，而口腔鱗癌極易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和腫瘤浸潤(rùn)前沿明顯的異質(zhì)性也提示腫瘤細(xì)胞可能存在抗凋亡特性[6]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)：不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株細(xì)胞外形存在明顯差別，高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株細(xì)胞粘附性差，外形梭形變明顯，低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株外形圓形比率較高，同時(shí)圖像分析軟件對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)指標(biāo)分析顯示高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組細(xì)胞異型性更加明顯，高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株細(xì)胞面積、周長(zhǎng)、等效直徑、長(zhǎng)徑、短徑明顯高于低轉(zhuǎn)移組；長(zhǎng)短比、形狀因子、圓形度、異形指數(shù)間比較無明顯差別；高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的細(xì)胞變異參數(shù)在面積、周長(zhǎng)、等效直徑、長(zhǎng)徑、短徑間明顯高于低轉(zhuǎn)移組組；長(zhǎng)短比、形狀因子、圓形度、異形指數(shù)間比較無明顯差別，說明高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的梭形變和粘附力降低是惡性程度增加的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，提示參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換為間質(zhì)浸潤(rùn)提供表面分子表型改變。

腫瘤細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力是完成轉(zhuǎn)移過程的前提，但并非所有的腫瘤細(xì)胞都具有這種能力并完成整個(gè)過程，經(jīng)典理論認(rèn)為轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞高度克隆選擇的過程。腫瘤轉(zhuǎn)移潛能在原發(fā)瘤階段即已獲得，在進(jìn)展過程中受到內(nèi)外界因素的影響而調(diào)節(jié)。同時(shí)細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的細(xì)胞自主性死亡過程，是在促凋亡因素和抗凋亡因素共同調(diào)節(jié)下得以正常進(jìn)行的，是維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)平衡紊亂與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。因此運(yùn)用基因增補(bǔ)法將能有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，使其表達(dá)產(chǎn)物補(bǔ)償缺陷基因的功能或使原有的促凋亡功能得到加強(qiáng)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[7-9]。腫瘤細(xì)胞在抑制失巢凋亡同時(shí)獲得基因型及細(xì)胞表型的改變，使其更具侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而細(xì)胞周期是最能反映細(xì)胞增殖活性改變的客觀指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)顯示：口腔鱗癌細(xì)胞株高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組細(xì)胞凋亡指數(shù)(P<0.05)。高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株G1期比率明顯低于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株；G2期比率在2組細(xì)胞株間無明顯差異(P>0.05)；S期比率在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株明顯高于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(P<0.05)，說明高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組細(xì)胞明顯處于高代謝狀態(tài)，增殖活性較高，遺傳物質(zhì)合成占優(yōu)勢(shì)，而低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞G1期占優(yōu)勢(shì)，說明其增殖活性低于高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。因此，對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控因子的研究將有利于探索惡性腫瘤發(fā)生的奧秘，為進(jìn)一步治療腫瘤奠定基礎(chǔ)。

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2013-12-11)