UPLC法同時(shí)測(cè)定穿心蓮藥材中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量*

★ 程帆 劉鵬 劉地發(fā) 劉艷紅 楊小玲*

(江西青峰藥業(yè)有限公司 江西 贛州 341000)

穿心蓮為爵床科植物穿心蓮AndrographisPaniculata(Burm. f.)Nees的地上干燥部分。具有清熱解毒、涼血、消腫功效。用于感冒發(fā)熱，咽喉腫痛，口舌生瘡[1]等疾病的治療。隨著抗生素濫用及不良反應(yīng)的增加，開發(fā)具有良好抗菌效果中藥的呼聲越來越高。喜炎平注射液抗菌作用顯著[2]，其使用的藥材為穿心蓮，因此，嚴(yán)格控制穿心蓮藥材的質(zhì)量，就顯得尤為重要。

《中國(guó)藥典》2010年版一部第251～252頁規(guī)定，采用HPLC法測(cè)定其中的穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量，來保證穿心蓮藥材的質(zhì)量。然而采用普通的HPLC法測(cè)定時(shí)，存在分析時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。本文采用UPLC法[3,4]同時(shí)測(cè)定穿心蓮藥材中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，該方法大大縮短了分析時(shí)間(只需要15min分析一份樣品)，且重現(xiàn)性好、易于操作，可為穿心蓮藥材的質(zhì)量控制提供新的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-30A/PDA超高效液相色譜系統(tǒng)，CP225D電子天平(賽多利斯儀器有限公司)，KQ-250E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，250W，40KHz)。

1.2 試藥 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110797-201108)，脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110854-201106)，穿心蓮藥材(5批，產(chǎn)地分別為廣東湛江、廣東清遠(yuǎn)、海南、廣西)，甲醇為色譜純,水為純化水，其余試劑均為分析純。

A.空白溶劑 B.對(duì)照品 C.供試品

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Shimadzu Shim-pack XR-ODSⅢ(2.0mm×75mm，1.6μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(48∶52)；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：穿心蓮內(nèi)酯為225nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯為254nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1μL。在此色譜條件下，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的理論塔板數(shù)均不低于2000，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5?？瞻兹軇?duì)樣品測(cè)定無干擾。結(jié)果見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含穿心蓮內(nèi)酯200μg、脫水穿心蓮內(nèi)酯100μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取穿心蓮藥材粉末(過4號(hào)篩)0.1028g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，稱定重量，浸泡1小時(shí)，超聲處理30min，放冷，再次稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品溶液0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL，分別置于10mL量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各1μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算?；貧w方程分別為：穿心蓮內(nèi)酯Y=6448.8180X-5748.0330(r=0.9996，n=6)；脫水穿心蓮內(nèi)酯Y=4955.7871X+402.1762(r=0.9998，n=6)。結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯在10.065～161.04ng(r=0.9996)、脫水穿心蓮內(nèi)酯在5.14～82.24ng(r=0.9998)范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1L，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.37%(n=6)、0.69%(n=6)。結(jié)果表明，方法的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按上述色譜條件，于0h、2h、4h、8h、10h、12h各測(cè)定一次，記錄色譜峰面積。穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.41%(n=6)、0.83%(n=6)。結(jié)果表明，供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一穿心蓮藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法重復(fù)制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積。穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD分別為1.22%(n=6)、1.57%(n=6)。結(jié)果表明，方法的重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

2.8.1 穿心蓮內(nèi)酯加樣回收率 取本品適量，研細(xì)，取約100mg，精密稱定，共6份，置50mL量瓶中，分別精密加入穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液(0.2013mg/mL)15mL，其余按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯平均回收率為99.25%，RSD=1.03%(n=6)。

2.8.2 脫水穿心蓮內(nèi)酯加樣回收率 取本品適量，研細(xì)，取約100mg，精密稱定，共6份，置10mL量瓶中，分別精密加入脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液(0.1011mg/mL)5mL，其余按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果脫水穿心蓮內(nèi)酯平均回收率為98.43%，RSD=1.33%(n=6)，詳見表1、表2。

表1 穿心蓮內(nèi)酯回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

表2 脫水穿心蓮內(nèi)酯回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

表3 UPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地穿心蓮藥材穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量 %

2.9 樣品含量測(cè)定 取穿心蓮藥材樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，并分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見表3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[5]，考察了甲醇-水、乙睛-水等不同流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果以甲醇-水(48∶52)為流動(dòng)相，對(duì)兩個(gè)化合物及相鄰雜質(zhì)峰的分離較好，且基線平穩(wěn)、分析時(shí)間適中。

UPLC法測(cè)定穿心蓮藥材中的穿心蓮內(nèi)酯含量和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量，在保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，具有色譜峰分離度更好，檢測(cè)靈敏度更高及分析更快速等優(yōu)勢(shì)，降低溶劑損耗及分析成本；且測(cè)定結(jié)果與傳統(tǒng)HPLC法測(cè)定的結(jié)果完全一致，證明該方法能成功替代傳統(tǒng)的HPLC法，為穿心蓮藥材的質(zhì)量控制提供新的檢測(cè)方法。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典·一部[S]北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：251-252.

[2]馬學(xué)梅，史美惠．單用喜炎平及合用抗生素對(duì)上呼吸道感染患兒熱程影響的對(duì)照觀察[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué)，2009，1(6):513-514.

[3]陳佳，王鋼力，姚令文，等．超高效液相色譜(UPLC)在藥物分析領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].藥物分析雜志，2008，28(11)：1 976-1 980.

[4]單玲玲，靳光乾，劉善新.UPLC、RRLC及UFLC在中藥質(zhì)量控制中的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(10)：2 340-2 344.

[5]傅曉燕，黃巧玲．HPLC與UPLC法對(duì)比測(cè)定兩種川芎藥材中阿魏酸的含量[J].中藥材，2011，34(7)：1 070-1 072.