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      殼聚糖膠囊對(duì)小鼠免疫功能的影響

      2014-08-29 06:29:38吳丹余永紅
      關(guān)鍵詞:玻片殼聚糖紅細(xì)胞

      ★ 吳丹 余永紅

      (1.江西省藥品審評(píng)中心 江西 南昌 330046;2.江西省食品藥品檢驗(yàn)所 江西 南昌 330029)

      殼聚糖的免疫調(diào)節(jié)功能被廣泛研究,殼聚糖灌胃處理可以使小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)增高,細(xì)胞免疫、體液免疫、單核-巨嗜細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性增強(qiáng)[1,2]。黃俊民等研究表明殼聚糖能提高綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力,增強(qiáng)小鼠的血清溶血素抗體反應(yīng)和巨嗜細(xì)胞的吞噬反應(yīng)[3]。殼聚糖膠囊為口服固體保健食品,其有效成分D-氨基葡萄糖鹽酸鹽含量大于85.1g/100g,本實(shí)驗(yàn)對(duì)其增強(qiáng)免疫功能進(jìn)行了相關(guān)研究。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      1.1.1 樣品 殼聚糖膠囊內(nèi)容物。折合劑量0.033 3g/kg·bw(成人體重以60kg計(jì))。

      1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種雌性小鼠,200只,SPF級(jí),重18~22g。購(gòu)自江西中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格號(hào):JZDWNO.2013-0137)。

      1.1.3 主要儀器 分光光度計(jì):722型,上海精科儀器有限公司;二氧化碳培養(yǎng)箱:MCO-20AIC,日本三洋電器集團(tuán);酶標(biāo)儀:PT-3502,北京普天新橋技術(shù)有限公司;顯微鏡:BX53,奧林巴斯中國(guó)有限公司;24孔、96孔平底培養(yǎng)板和U型96孔培養(yǎng)板:上海臥宏生物科技有限公司。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 將200只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組:I(碳廓清)、II(腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞)、III(遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng))、IV(臟體比值、半數(shù)溶血值和抗體生成細(xì)胞數(shù)的測(cè)定)、V(ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、NK細(xì)胞活性測(cè)定)。每組設(shè)低、中、高劑量組及對(duì)照組。每組為10只小鼠[4]。

      1.2.2 劑量選擇及樣品處理 按體重設(shè)0.167g/kg·bw(低)、0.333g/kg·bw(中)、1.000g/kg·bw(高)三個(gè)劑量,配制時(shí)分別取殼聚糖內(nèi)容物1.67g、3.33g、10.00g用1%CMC定容至200mL,給小鼠灌胃(0.2mL/10g·bw),對(duì)照組予以等體積的1%CMC,每天1次,連續(xù)灌胃30d[4]。

      1.2.3 臟器重和體重測(cè)定 處死小鼠前稱(chēng)重,解剖取胸腺和脾臟并稱(chēng)重,計(jì)算胸腺/體重和脾臟/體重比值[4]。

      1.2.4 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH) 用0.2mL的2%(v/v)SRBC對(duì)每只小鼠注射腹腔致敏,4d后測(cè)量左后足跖厚度,在測(cè)量部位用20μL的20%(v/v)SRBC對(duì)每只小鼠行皮下注射,于24h后再次測(cè)量左后足跖厚度,測(cè)3次取平均值,計(jì)算攻擊前后足跖厚度之差[4]。

      1.2.5 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(MTT法) 無(wú)菌操作取脾置于Hank's溶液中制備細(xì)胞懸液,過(guò)200目篩;用Hank's溶液洗滌并離心(10min,1 000r/min)2次;將細(xì)胞移入1mL完全培養(yǎng)液中計(jì)數(shù),再用RPMI1640溶液配制濃度為3×106個(gè)/mL的細(xì)胞液;分2孔加入24孔培養(yǎng)板,每孔1mL,一孔為5%CO2對(duì)照,另一孔加75μLConA(濃度為75μg/mL)液,37℃培養(yǎng)68h后從各孔小心吸去0.7mL上清液,再加0.7mLRPMI1640培養(yǎng)液(不含小牛血清)和MTT50μL(5mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)至72h;再往各孔加1mL酸性異丙醇,吹打混勻,溶解紫色結(jié)晶后分裝至96孔板,各設(shè)3個(gè)平行樣,570nm處測(cè)定OD1和OD2值,計(jì)算公式[4]:

      R=OD1-OD2

      R:淋巴細(xì)胞增殖能力;OD1:光密度(加ConA);OD2:光密度(不加ConA)。

      1.2.6 抗體生成細(xì)胞檢測(cè) 用生理鹽水(NS)洗滌羊血3次,每次離心(10min,2 000r/min)得壓積SRBC,再用NS制備的2%(v/v)細(xì)胞懸液注射小鼠腹腔(每只0.2mL),4d后,無(wú)菌取脾小心磨碎,用Hank's液制備濃度為5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液;將溶解好的表層培養(yǎng)基與等量2倍濃度Hank's液(pH7.4)混合,以每試管0.5mL用量分裝,再加50μL 10%(v/v)SRBC和20μL細(xì)胞懸液,迅速混勻,傾倒于制備好的瓊脂糖玻片上,凝固好將玻片平扣于玻片架上,用CO2培養(yǎng)箱溫育1.5h,在玻片凹槽中倒入補(bǔ)體(用SA液1∶8比例稀釋)繼續(xù)溫育1.5h,計(jì)數(shù)溶血空斑[4]。

      1.2.7 半數(shù)溶血值(HC50)的測(cè)定 用羊血制備0.2mL 2%(v/v)SRBC并注射小鼠腹腔進(jìn)行免疫,4d后摘眼球以離心管取血,靜置1h,離心(10min,2 000r/min)收集血清,用SA緩沖液稀釋至200倍后取1mL到試管中,順次加入0.5mL 10%(v/v)SRBC(SA配置)、補(bǔ)體1mL(用SA液1∶8比例稀釋);并設(shè)SA對(duì)照組。水浴37℃保溫30min后冰浴終止反應(yīng),離心(10min,1 900r/min),取1mL上清液和3mL都氏試劑到試管中,于另一試管中加0.25mL 10%(v/v)SRBC(SA配置)和3.75mL都氏試劑,混勻靜置12min,在540nm處測(cè)OD值,對(duì)照作空白,計(jì)算公式[4]:

      HC50=OD1值/OD2值×R

      HC50:半數(shù)溶血值;OD1:樣品OD值;OD2:SRBC半數(shù)溶血OD值;R:稀釋倍數(shù)。

      1.2.8 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn) 印度墨汁用NS稀釋4倍,在小鼠尾靜脈進(jìn)行注射(0.01mL/g),注射完立即計(jì)時(shí),于第2min、10min分別從內(nèi)眥靜脈叢采血20μL,加入到2mL 0.1%Na2CO3溶劑中混勻;溶劑為空白對(duì)照,在600nm處測(cè)OD值。解剖小鼠取肝和脾稱(chēng)重,計(jì)算吞噬指數(shù)a[4]。

      1.2.9 小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 離心制備雞紅細(xì)胞(1 900r/min,離心10min),用NS配置成20%(v/v)細(xì)胞懸液,取1mL注射小鼠腹腔,30min后處死以鼠板固定,從腹部中央剪開(kāi)皮膚,注射2mL NS,轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板約1min制備腹腔巨噬細(xì)胞洗液,取1mL滴于載玻片上,在保濕盒中溫育后(37℃,30min),以NS漂洗,晾干,以丙酮:甲醇(1∶1)溶液固定,再用4%(v/v)Giemsa-PBS液染色,再漂洗,再晾干,顯微鏡下計(jì)數(shù)(每個(gè)玻片計(jì)數(shù)100個(gè)),計(jì)算公式[4]:

      A%=B/C×100

      A:吞噬率%;B:吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù);C:計(jì)數(shù)的巨嗜細(xì)胞數(shù)。

      T=Y/C

      T:吞噬指數(shù);Y:被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù);C:計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)。

      1.2.10 NK細(xì)胞活性的測(cè)定 處死小鼠后無(wú)菌取脾,脾細(xì)胞用Hank's液洗滌、離心(10min,1 000 r/min)2次,棄上清,加0.5mL無(wú)菌水,待紅細(xì)胞裂解后(約20s),再加0.5mL 2倍Hank's液和8mL Hank's液,離心處理(1 000 r/min,10min),再重懸(用1mL含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液),用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù);再將活細(xì)胞濃度調(diào)整至2×107個(gè)/mL,此為效應(yīng)細(xì)胞,配制細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL的YAC-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞(RPMI1640培養(yǎng)液);各取100μL(效∶靶=50∶1)到96孔U型板中培養(yǎng),將培養(yǎng)液和靶細(xì)胞各100μL加到靶細(xì)胞自然釋放孔中,將靶細(xì)胞和2.5%Triton各100μL加到靶細(xì)胞最大釋放孔中,均需設(shè)3個(gè)平行樣,37℃,5% CO2培養(yǎng)4h后離心(5min,1 500r/min),取100μL上清液到96孔平底培養(yǎng)板中,并加LDH基質(zhì)100μL,室溫反應(yīng)3~10min,各孔加1mol/L的HCL30μL,490nm處測(cè)定,計(jì)算公式[4]:

      A=[(OD1-OD2)/(OD3-OD2)]×100%

      A:NK細(xì)胞活性;OD1:反應(yīng)孔OD值;OD2:自然孔釋放OD值;OD3:最大釋放孔OD值。

      2 結(jié)果

      2.1 對(duì)體重和臟器/體重比的影響 體重觀測(cè)發(fā)現(xiàn),各劑量組小鼠體重變化、脾臟/體重比及胸腺/體重比,與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。

      2.2 對(duì)細(xì)胞免疫的影響 表1表明,高劑量組小鼠足跖腫脹程度顯著高于對(duì)照組(P<0.01),且能顯著增加小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力(P<0.05)。

      表1 對(duì)細(xì)胞免疫的影響

      2.3 對(duì)體液免疫的影響 由表2可知,高劑量組能顯著增加抗體生成細(xì)胞數(shù)和半數(shù)溶血值(P<0.05)。中、高劑量能顯著增加NK細(xì)胞活性(P<0.05)。各劑量對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞能力和小鼠巨嗜細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力無(wú)明顯影響,與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

      表2 對(duì)體液免疫的影響

      3 結(jié)論

      實(shí)驗(yàn)研究表明,經(jīng)口給予小鼠0.167g/kg·bw(低)、0.333g/kg·bw(中)、1.000g/kg·bw(高)三個(gè)劑量殼聚糖膠囊內(nèi)容物30d,高劑量可以增加小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、抗體生成細(xì)胞數(shù)、血清半數(shù)溶血值,與對(duì)照組比較具有顯著差異性(P<0.05或P<0.01);中、高劑量能增加小鼠NK細(xì)胞活性,與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05);對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)、脾臟/體重比值、胸腺/體重比值及小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力無(wú)明顯影響(P>0.05)。提示該殼聚糖膠囊產(chǎn)品具有增強(qiáng)免疫力的功能。

      [1]王曉玲.甲殼素和殼聚糖在食品工業(yè)中應(yīng)用的新進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2007,28(10):163-166.

      [2]雷朝亮,鐘昌珍.蠅蛆幾丁糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1997,16(3):259-262.

      [3]黃俊民,吳麗明,陳瑞儀.甲殼素和殼聚糖對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)的研究[J].廣東衛(wèi)生防疫,1999,25(1):4-6.

      [4]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范[M].北京:2003:961-1001.

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