趙婷婷 王庸晉 曹文君 王治平 燕李晨

PPARs激動(dòng)劑對RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響

趙婷婷 王庸晉 曹文君 王治平 燕李晨

目的 探討PPARs激動(dòng)劑吡格列酮對RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響。方法 首先用50 mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）將體外培養(yǎng)的RAW264.7巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化為泡沫細(xì)胞，然后進(jìn)行油紅O染色，并在光鏡下鑒定泡沫細(xì)胞形態(tài)及變化；再以不同濃度吡格列酮（0μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L）作用泡沫細(xì)胞 24 h，以 30 μmol/L的吡格列酮作用 0 h、6 h、12 h、24 h、48 h；最后酶法檢測泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量。結(jié)果 ①50 mg/Lox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞48 h后分化為泡沫細(xì)胞。②與對照組相比，不同濃度吡格列酮作用后泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且呈劑量依賴性。③與對照組相比，30μmol/L的吡格列酮作用6 h、12 h、24 h、48 h后，泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且呈時(shí)間依賴性。結(jié)論 PPARs激動(dòng)劑吡格列酮能夠減少泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，且呈劑量和時(shí)間依賴性。

巨噬細(xì)胞； 吡格列酮； 膽固醇； 動(dòng)脈粥樣硬化

泡沫細(xì)胞由巨噬細(xì)胞吞噬大量氧化修飾的低密度脂蛋白，致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積而形成，是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)出現(xiàn)的特征性病理細(xì)胞。血脂水平增高會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，促進(jìn)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成，加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程[1]。因此，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的形成和堆積已成為防治動(dòng)脈粥樣硬化的一種有效治療策略。吡格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物，是已知的PPARγ激動(dòng)劑。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，吡格列酮可改善高脂血癥大鼠血脂水平，延緩主動(dòng)脈粥樣硬化病理改變[2]。本研究通過測定過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）激動(dòng)劑吡格列酮對RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響，進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制，為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 RAW264.7巨噬細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，DEME培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶均購自 Hyclone公司，低密度脂蛋白（LDL）購自上海生物工程有限公司，吡格列酮購自石藥集團(tuán)遠(yuǎn)大（大連）制藥有限公司，膽固醇測定試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司，其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 低密度脂蛋白（LDL）的氧化修飾 用pH 7.2 0.01 mol/LPBS將LDL濃度調(diào)整為1.6 g/L，加入CuSO4使LDL溶液終濃度為10 μmol/L，37℃氧化12 h，將溶液裝入透析袋，4℃條件下透析24 h以終止氧化。期間換液10次，前4次在透析液中加入終濃度為0.5 mmol/L的EDTA以終止氧化，用0.45 μm濾膜過濾除菌，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞。待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，接種至6孔培養(yǎng)板，密度為4×105/孔，加入50 mg/ml的ox-LDL孵育48 h，誘導(dǎo)分化成泡沫細(xì)胞。

1.4 油紅O染色 將細(xì)胞培養(yǎng)于放有消毒蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞終止培養(yǎng)后，棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗3次，60%異丙醇固定30 min，吸去固定液后PBS洗3次，油紅O染色液室溫染色30 min，棄去染色液PBS洗3次，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù)實(shí)驗(yàn) ①量效試驗(yàn)：對照組不做處理，實(shí)驗(yàn)組用 5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L的吡格列酮孵育RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞24 h。②時(shí)效實(shí)驗(yàn)：對照組不做處理，實(shí)驗(yàn)組用30 μmol/L的吡格列酮孵育RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞 6 h、12 h、24 h、48 h。

1.6 泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的檢測 0.1 mmol/L氯化鈉室溫作用30 min裂解細(xì)胞，BCA法測定蛋白質(zhì)的含量。沖入無水乙醇1 ml，分為等體積的2份，其中一份加入10 mol/L氫氧化鈉溶液500 μl，50℃水浴1 h，使酯化膽固醇轉(zhuǎn)化為游離膽固醇，用于總膽固醇的測定；另一份加入1 mol/L氫氧化鈉溶液500 μl，室溫放置2 h，為游離膽固醇的測定。膽固醇酯=總膽固醇－游離膽固醇。按試劑盒說明用酶比色法測定膽固醇的含量，在酶標(biāo)儀上測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)品在500 nm處的吸光度值（OD），以mg/g計(jì)算其含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析（F檢驗(yàn)），多重比較采用LDL檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型的建立 RAW264.7巨噬細(xì)胞復(fù)蘇后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況：RAW264.7巨噬細(xì)胞貼壁生長，以類圓形和不規(guī)則多邊形為主，一般含1～2個(gè)核，有偽足，細(xì)胞胞體較小，生長快，5～6 d可融合（圖1）。巨噬細(xì)胞吞噬50 mg/ml ox-LDL 48 h后可見細(xì)胞體積明顯增大，胞內(nèi)有大小不等的脂滴（見圖2）。油紅O染色后，巨噬細(xì)胞大量紅染物質(zhì)（見圖3）。

2.2 不同濃度吡格列酮對RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響 用 50 mg/ml ox-LDL培養(yǎng) RAW264.7巨噬細(xì)胞48 h，使其誘導(dǎo)分化為泡沫細(xì)胞，再加不同濃度吡格列酮作用24 h，酶法檢測泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量。結(jié)果顯示，隨著吡格列酮濃度增加，細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（TC）、膽固醇酯（CE）的含量及TC/CE顯著下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），并呈明顯劑量依賴性。見表1。

2.3 30 μmol/L吡格列酮作用RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞不同時(shí)間后對細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響 與對照組相比，30 μmol/L吡格列酮作用于泡沫細(xì)胞 6 h、12 h、24 h、48 h 后，細(xì)胞內(nèi) TC、CE及TC/CE明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），并呈明顯的時(shí)間依賴性。見表2。

表1 不同濃度吡格列酮作用RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞24 h后對細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響（±s）

表1 不同濃度吡格列酮作用RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞24 h后對細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與 5 μmol/L 比較，bP＜0.01；與 10 μmol/L 比較，cP＜0.01；與 20 μmol/L 比較，dP＜0.01

組別 例數(shù) TC CE CE/TC對照組 5 86.55±2.96 47.61±2.88 0.55±0.11 5 μmol/L 5 67.25±1.81 36.90±1.63 0.54±0.02 10 μmol/L 5 54.29±4.13ab 25.65±1.84ab 0.47±0.05ab20 μmol/L 5 41.24±2.43abc 16.13±2.24abc 0.39±0.04abc30 μmol/L 5 31.24±3.81abcd 10.79±3.61abcd 0.34±0.06abcd

表2 30 μmol/L吡格列酮作用RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞不同時(shí)間后對細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響（±s）

表2 30 μmol/L吡格列酮作用RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞不同時(shí)間后對細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與 6 h 比較，bP＜0.01；與 12 h 比較，cP＜0.01；與24 h比較，dP＜0.01

組別 例數(shù) TC CE CE/TC對照組 5 81.35±2.17 45.07±0.88 0.55±0.05 6 h 5 69.22±0.75 33.90±1.36 0.49±0.04 12 h 5 52.73±1.35ab 21.72±0.90ab 0.40±0.01ab24 h 5 34.94±1.55abc 11.54±0.79abc 0.33±0.02abc48 h 5 21.13±2.06abcd 6.15±1.19abcd 0.29±0.07abcd

3 討論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高及生活方式的改變，我國居民的平均血清TC水平在逐步升高。與此同時(shí)，與血脂異常密切相關(guān)的糖尿病和代謝綜合征在我國也十分常見。致動(dòng)脈粥樣硬化脂蛋白譜由一組血脂異常組成，包括TG升高、HDL-C低和小而致密LDL升高[3]。在動(dòng)脈內(nèi)膜受損的情況下，血液中的單核細(xì)胞黏附在內(nèi)皮細(xì)胞上的數(shù)量增多，并通過內(nèi)皮間隙在內(nèi)膜下轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，通過A型清道夫受體（SR-A）吞噬大量ox-LDL，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，最終形成泡沫細(xì)胞[4]。因此，減少膽固醇的流入或促進(jìn)其流出對防治AS的發(fā)生具有十分重要的意義。這一過程受到細(xì)胞膜上不同脂質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體的介導(dǎo)，如三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子（ABCAl與ABCGl）和清道夫受體（SRBI）等。這些脂質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體構(gòu)成了細(xì)胞脂質(zhì)釋放的特異性途徑，即ABCAl徑路、ABCGl徑路、SR-BI徑路及非特異性的液相擴(kuò)散徑路[5]。高密度脂蛋白（HDL）和載脂蛋白A-I（apoA-I）是血漿內(nèi)膽固醇天然受體，對于膽固醇流出也十分重要[6]。

吡格列酮作為更新一代的人工合成PPARγ激動(dòng)劑，有更高的配體親和力。吡格列酮的主要作用有調(diào)節(jié)血糖、增加胰島素敏感性，同時(shí)還有較好的心血管保護(hù)作用[7]。Nakaya等[8]發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可以阻止高脂飲食的基因敲除LDLR的小鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。Clark等[9]通過評價(jià)吡格列酮對肥胖貓胰島素抵抗的影響，發(fā)現(xiàn)吡格列酮不僅可以顯著改善肥胖貓胰島素抵抗，同時(shí)還可以改善肥胖貓的脂質(zhì)代謝。雖然目前對吡格列酮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制不甚清楚，有學(xué)者通過研究認(rèn)為吡格列酮和22羥膽固醇協(xié)同作用減少脂質(zhì)沉積，可能通過激活 PPARγ-LXRα-ABCA1通路，上調(diào)ABCA1基因的表達(dá)，增加膽囊上皮細(xì)胞膽固醇的流出[10]。此外，Vaccinate發(fā)現(xiàn)吡格列酮可在HepG2細(xì)胞中誘導(dǎo)ApoAI的轉(zhuǎn)錄，改善高密度脂蛋白的功能，阻止動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)一步發(fā)展[11]。

本實(shí)驗(yàn)以RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞為研究對象，加入50 mg/ml ox-LDL誘導(dǎo)分化建立泡沫細(xì)胞細(xì)胞模型，經(jīng)油紅O染色，在光鏡下可見胞漿內(nèi)有明顯的紅染脂質(zhì)顆粒，在形態(tài)學(xué)上符合泡沫細(xì)胞，表明采用上述方法成功建立了RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著吡格列酮濃度增加及作用時(shí)間延長，巨噬細(xì)胞內(nèi)TC、CE含量逐漸減少，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示吡格列酮可明顯減少巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇酯聚積，促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇流出。吡格列酮是通過上述何種途徑參與調(diào)節(jié)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的變化，仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

PPARs激動(dòng)劑對RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響 P1040

圖1 RAW264.7巨噬細(xì)胞10×20 倍

圖2 ox-LDL誘導(dǎo)后泡沫細(xì)胞10×20 倍

圖3 泡沫細(xì)胞油紅O染色10×40 倍

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全劑量ARB/HCTZ（氯沙坦鉀/100 mg/氫氯噻嗪12.5 mg）正式全國上市

“我國是一個(gè)高血壓大國，流行病學(xué)調(diào)查提示，目前我國高血壓防控現(xiàn)狀呈現(xiàn)‘三高三低’，即患病率高、死亡率高、致殘率高和知曉率低、治療率低、控制率低。因此，加強(qiáng)我國高血壓臨床診療規(guī)范性，普及患者教育，提高其對治療的依從性是高血壓防控工作中的重要內(nèi)容，而優(yōu)化的高血壓治療方案可增加療效從而改善患者依從性。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）與利尿劑是兩種不同降壓機(jī)制藥物，其聯(lián)合治療是國內(nèi)外指南推薦的優(yōu)選組合之一?！边@是中國老年學(xué)學(xué)會(huì)心腦血管病專業(yè)委員會(huì)主任委員胡大一教授對我國高血壓現(xiàn)狀所做的介紹。

2014年10月17日，在第25屆長城國際心臟病學(xué)會(huì)議上，正式發(fā)布了氯沙坦鉀/氫氯噻嗪片（100 mg/12.5 mg）上市信息。與會(huì)的專家均一致表示，全劑量的ARB/HCTZ如氯沙坦鉀/100 mg/氫氯噻嗪12.5 mg將在幫助高血壓患者的血壓盡快達(dá)標(biāo)，并提供更有效的靶器官保護(hù)方面，將是臨床更好的選擇。

中國醫(yī)師協(xié)會(huì)心血管分會(huì)會(huì)長馬長生教授表示：“全劑量的ARB/HCTZ如氯沙坦鉀/100mg/氫氯噻嗪12.5 mg將在幫助高血壓患者的血壓盡快達(dá)標(biāo)，并提供更有效的靶器官保護(hù)方面，將是臨床更好的選擇。細(xì)究ARB相關(guān)的循證研究可發(fā)現(xiàn)，獲得陰性或中性結(jié)果的研究ARB劑量多不足，而采用大劑量ARB的LIFE研究（氯沙坦平均劑量為82 mg/d）和RENAAL研究（氯沙坦平均劑量為86 mg/d）均獲得了陽性結(jié)果，提示表觀分布容積較低、藥物無法到達(dá)靶器官或是相關(guān)研究未獲得陽性結(jié)果的原因。故對表觀分布容積較低的大多數(shù)ARB而言，如果要想達(dá)到較好的靶器官保護(hù)療效，必須要提高劑量?！?/p>

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院朱建華教授指出：“由于高血壓的發(fā)病機(jī)制尚未明晰，故目前的治療需要多途徑阻斷其發(fā)病機(jī)制，這是聯(lián)合治療的理論基礎(chǔ)。此外，既往臨床研究顯示，提高單藥治療的劑量并不能使療效相應(yīng)增長，而不良反應(yīng)發(fā)生率則會(huì)上升，提示僅增加單藥治療劑量并不是降壓的好方法。采用不同機(jī)制的降壓藥物聯(lián)合治療可以達(dá)到增加療效、降低不良反應(yīng)發(fā)生率的作用，此種‘黃金搭檔’不一定需要采用兩種非常強(qiáng)效的藥物，作用機(jī)制互補(bǔ)的藥物往往療效佳、不良反應(yīng)少，讓患者可以堅(jiān)持服藥，最終提高血壓達(dá)標(biāo)率?！?/p>

北京大學(xué)人民醫(yī)院孫寧玲教授回顧了在去年更新的高血壓指南（JNC8，2013ESH/ESC）的明確建議，強(qiáng)調(diào)應(yīng)更及時(shí)、更普遍進(jìn)行聯(lián)合降壓治療。與以往指南相比，新指南還特別強(qiáng)調(diào)聯(lián)合降壓治療也應(yīng)使用足劑量，使用臨床試驗(yàn)驗(yàn)證過的足劑量，以提高降壓治療的達(dá)標(biāo)率。足劑量增加的降壓療效是顯而易見的，其治療效果（efficacy）與效率（efficiency）都顯著增加,對ARB與利尿劑組成的復(fù)方制劑而言，還可以顯著減少不良反應(yīng)，提高降壓治療的耐受性和依從性，從而實(shí)現(xiàn)更多降壓獲益。

“除降壓療效外，在保護(hù)靶器官方面，LIFE研究證實(shí)ARB氯沙坦（100 mg）與和利尿劑氫氯噻嗪（12.5 mg）聯(lián)合治療可降低伴左心室肥厚的高血壓患者心血管疾病的發(fā)生率和死亡率，且不良反應(yīng)較少，提示ARB聯(lián)合小劑量利尿病可使患者療效改善，并減少不良反應(yīng)的發(fā)生。另有研究顯示，增加ARB劑量可增加其器官保護(hù)作用，因此，對于ARB聯(lián)合小劑量利尿劑的治療方案可根據(jù)患者情況增加ARB劑量（如氯沙坦100 mg）或可為患者帶來更佳的療效，同時(shí)不增加治療帶來的不良反應(yīng)。而臨床實(shí)踐也表明，這種聯(lián)合方式具有更好的依從性和療效。”中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院董吁鋼教授又作出了如上補(bǔ)充。

The effects of PPARs agonist on cholesterol levels in RAW264.7 macrophage-derived foam cell

ZHAO Ting-ting＊，WANG Yong-jin，CAO Wen-jun，et al.＊Department of Cardiology，Shanxi Medical University First Subsidary Clinical Hospital，Taiyuan 030001，China

WANG Yong-jin，E-mail：yongjinwang2008@sohu.com

Objective To observe the effects of PPARs agonist Pioglitazone on cholesterol levels in RAW264.7 macrophage-derived foam cell.Methods Firstly，with 50 mg/L oxidized low density lipoprotein（ox-LDL） induce the mouse RAW264.7 cells into foam cells.Secondly，using red oil O staining technique and transmission light microscope was applied to appraise the morphology and change of foam cells.Thirdly，Pioglitazone of different concentrations（0 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，30 μmol/L） were incubated with RAW264.7 macrophage-derived foam cell for 24 h and 20μmol/L pioglitazone were incubated with RAW264.7 macrophage-derived foam cell for 6 h，12 h，24 h，48 h.Lastly，the cholesterol content of foam cells was measured by enzyme assay.Results ⑴The mouse RAW264.7 cells could be differentiated into macrophages after 48h induction by 50 mg/L oxidized low density lipoprotein（ox-LDL）.⑵Compared with the control group，treatment of RAW264.7 macrophage-derived foam cell with 5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，30 μmol/L pioglitazone for 24 h，resulted in an decrease in the cholesterol content of foam cells，differences are statistically significant（P＜0.01）.⑶Compared with the control group，treatment of RAW264.7 macrophage-derived foam cell with 20 μmol/L pioglitazone for 6 h，12 h，24 h，48 h，resulted in a decrease in the cholesterol content of foam cells，differences were statistically significant（P＜0.01）.Conclusion PPARs agonist pioglitazone reducescholesterol levels in foam cells in dose and time dependent.

Macrophage； Pioglitazone； Cholesterol； Atherosclerosis

山西省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：20130321029-01），山西省“131”領(lǐng)軍人才資助項(xiàng)目

030001 山西省太原市，山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院心內(nèi)科（趙婷婷）；長治醫(yī)學(xué)院心血管研究所（趙婷婷、王庸晉、曹文君、燕李晨）；長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院心內(nèi)科（王庸晉、王治平）

王庸晉，E-mail:yongjinwang2008@sohu.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2014．11．023

R541.4

A

1672-5301（2014）11-1040－04

2014-07-11）