楊興爽

正常早孕與稽留流產(chǎn)絨毛組織結(jié)構(gòu)中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的對(duì)比研究

楊興爽

目的 研究凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax在正常早孕與稽留流產(chǎn)絨毛組織結(jié)構(gòu)中的表達(dá)及其意義, 探討稽留流產(chǎn)原因。方法 選擇本院就診的稽留流產(chǎn)患者和早孕人工流產(chǎn)患者各60例, 分為A組、B組。流產(chǎn)后立即留取胚胎絨毛組織送病理。分別應(yīng)用光鏡觀察各組絨毛組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變；同時(shí)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和計(jì)算機(jī)圖文分析系統(tǒng)檢測(cè)Bax、Bcl-2在各組絨毛的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 稽留流產(chǎn)組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中凋亡指數(shù)為(33.32±0.79)%, 明顯高于對(duì)照組B組的(18.90±0.63)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Bax和Bcl-2在兩組合體滋養(yǎng)細(xì)胞中的陽(yáng)性率比較顯示, 稽留流產(chǎn)組中Bax陽(yáng)性率增高, Bcl-2陽(yáng)性率下降, Bcl-2/Bax比值降低, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論 蛻膜絨毛中Bax陽(yáng)性率增高和Bcl-2陽(yáng)性率下降可使絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡明顯增加, 并進(jìn)一步導(dǎo)致稽留流產(chǎn)發(fā)生。

Bax蛋白；Bcl-2蛋白；胎盤(pán)絨毛；稽留流產(chǎn)；免疫組織化學(xué)

稽留流產(chǎn)又稱過(guò)期流產(chǎn), 是由于早期妊娠失敗導(dǎo)致孕卵死亡的一種常見(jiàn)疾病, 發(fā)病率高。目前認(rèn)為可能的病因有：胚胎染色體異常、母體嚴(yán)重感染、生殖器官異常、內(nèi)分泌異常、免疫功能異常、不良環(huán)境因素等。其確定的機(jī)制仍然不清。由于病因尚不明確, 無(wú)有效的對(duì)癥預(yù)防治療方法, 給很多患者帶來(lái)了很大的痛苦, 也給臨床醫(yī)師帶來(lái)了很大的困惑。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、B型白細(xì)胞/2型淋巴細(xì)胞樣蛋白( Bcl-2) 是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因,也是目前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其在很多組織中的表達(dá)有所研究, 但對(duì)稽留流產(chǎn)絨毛組織中的表達(dá)目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)正常早孕與稽留流產(chǎn)絨毛組織結(jié)構(gòu)中Bax、Bcl-2的表達(dá)進(jìn)行對(duì)比研究, 探討兩者之間的異同點(diǎn)及Bax/Bcl-2的平衡對(duì)維持正常妊娠的作用, 研究稽留流產(chǎn)絨毛組織結(jié)構(gòu)中Bax、Bcl-2的表達(dá)是否異常, 了解是否其表達(dá)異常是稽留流產(chǎn)原因之一, 可以幫助尋找稽留流產(chǎn)病因,為最終找到預(yù)防稽留流產(chǎn)的突破口奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院就診的稽留流產(chǎn)患者和早孕人工流產(chǎn)患者各60例, 分為A組(稽留流產(chǎn)組)和對(duì)照組B組(人工流產(chǎn)組)。A組年齡24~36歲, 平均(27.31±3.58)歲, 妊娠時(shí)間(56±5) d；B組年齡21~37歲, 平均(27.43±3.83)歲,妊娠時(shí)間(55±4) d；其年齡、妊娠時(shí)間、孕產(chǎn)次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。均未放置宮內(nèi)節(jié)育器, 流產(chǎn)前均未應(yīng)用任何藥物,無(wú)發(fā)熱、急性炎癥等表現(xiàn)。均經(jīng)B超確診宮內(nèi)正常早孕或稽留流產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 流產(chǎn)后立即留取肉眼可見(jiàn)的胚胎絨毛組織, 中性福爾馬林固定、制成病理切片。分別應(yīng)用光鏡觀察各組絨毛組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變；同時(shí)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和計(jì)算機(jī)圖文分析系統(tǒng)檢測(cè)Bax、Bcl-2在各組絨毛的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況。

1.2.2 方法 4 μm厚病理切片連續(xù)切片3張。一張用光鏡觀察各組絨毛組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變, 兩張行免疫組化染色。采用SP法, 微波爐枸椽酸鹽抗原修復(fù), DAB顯色。每批染色均設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照, 嚴(yán)格按試劑盒推薦方法染色。每張切片觀察5個(gè)視野, 計(jì)算出每100個(gè)滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡率。

1.2.3 結(jié)果判定 Bcl-2和Bax陽(yáng)性反應(yīng)均為胞漿、胞膜著棕黃色顆粒。細(xì)胞無(wú)黃色顆粒為陰性(-), 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在5%~25%為弱陽(yáng)性(+),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在25%~50%之間為陽(yáng)性(++), 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在50%~75%之間為陽(yáng)性(+++), >75%為強(qiáng)陽(yáng)性(++++)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s) 表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡結(jié)果 自然流產(chǎn)組絨毛組織結(jié)構(gòu)清晰, 外層為合體滋養(yǎng)細(xì)胞, 內(nèi)層為細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞, 排列緊密, 稽留流產(chǎn)組中的絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞變性、壞死, 甚至脫落, 間質(zhì)擴(kuò)張水腫,細(xì)胞分散, 血管擴(kuò)張, 并可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。兩組滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較,稽留流產(chǎn)組絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞中凋亡指數(shù)與對(duì)照組比較顯著增加, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01), 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩組滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(%)

2.2 免疫組化結(jié)果 Bax在蛻膜絨毛中的陽(yáng)性表達(dá)主要位于合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的胞漿中, Bcl-2主要分布于絨毛合體滋養(yǎng)層的胞質(zhì)內(nèi)。兩組滋養(yǎng)細(xì)胞Bcl-2、Bax陽(yáng)性率及Bcl-2/Bax比值比較, 稽留流產(chǎn)組合體滋養(yǎng)細(xì)胞中Bcl-2陽(yáng)性率較對(duì)照組低, 而B(niǎo)ax陽(yáng)性率較對(duì)照組高, Bcl-2/Bax比值降低, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01), 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 兩組滋養(yǎng)細(xì)胞Bax、Bcl-2陽(yáng)性率及Bcl-2/Bax比值比較

3 討論

胎盤(pán)是維持胚胎及胎兒在子宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)發(fā)育的重要器官。胎盤(pán)通過(guò)蛻膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖與凋亡, 不斷進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)的改善, 進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其功能的完善。胚泡植入、胎盤(pán)發(fā)育早期打破凋亡的調(diào)節(jié)可能直接或間接地影響妊娠的成?。?］。賀子秋等［2］向鼠腹膜內(nèi)注射人重組白介素-2致妊娠鼠流產(chǎn),發(fā)現(xiàn)其絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中凋亡較正常妊娠鼠高。正常妊娠胎盤(pán)組織的凋亡和增殖處于一種平衡狀態(tài), 這種平衡一旦被打破,發(fā)生異常凋亡, 將導(dǎo)致自然流產(chǎn)等病理妊娠的發(fā)生［3］。

稽留流產(chǎn)是妊娠早期最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一, 病因復(fù)雜。具體在哪個(gè)環(huán)節(jié)導(dǎo)致了胚胎停止發(fā)育尚不清楚。作者通過(guò)光鏡觀察研究發(fā)現(xiàn), 自然流產(chǎn)組, 也就是正常妊娠絨毛組織結(jié)構(gòu)清晰, 外層為合體滋養(yǎng)細(xì)胞, 內(nèi)層為細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞, 排列緊密, 而稽留流產(chǎn)組, 也就是胚胎停發(fā)后的絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞變性、壞死, 甚至脫落, 間質(zhì)擴(kuò)張水腫, 細(xì)胞分散, 血管擴(kuò)張, 并可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。說(shuō)明胎盤(pán)絨毛組織的變性壞死是導(dǎo)致胚胎死亡的主要原因。進(jìn)一步通過(guò)免疫組織化學(xué)方法和計(jì)算機(jī)圖文分析系統(tǒng)檢測(cè)Bax、Bcl-2在兩組絨毛中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)兩組滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較,稽留流產(chǎn)組絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞中凋亡指數(shù)與對(duì)照組比較顯著增加, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Bax在蛻膜絨毛中的陽(yáng)性表達(dá)主要位于合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的胞漿中, Bcl-2主要分布于絨毛合體滋養(yǎng)層的胞質(zhì)內(nèi)。兩組滋養(yǎng)細(xì)胞Bcl-2、Bax陽(yáng)性率及Bcl-2/ Bax比值比較, 稽留流產(chǎn)組合體滋養(yǎng)細(xì)胞中Bcl-2陽(yáng)性率較對(duì)照組低, 而B(niǎo)ax陽(yáng)性率較對(duì)照組高, Bcl-2/Bax比值降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

Bcl-2基因家族是目前廣泛研究的一類細(xì)胞凋亡相關(guān)基因, 其表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一。通過(guò)上調(diào)抗凋亡的Bcl-2的基因表達(dá), 可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以影響凋亡的發(fā)生。Bax是從人B細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)與Bcl-2共沉淀的另一類蛋白質(zhì), 它可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡,作用與Bcl-2相反。通過(guò)觀察Bcl-2和Bax在稽留流產(chǎn)與正常妊娠絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá), 發(fā)現(xiàn)稽留流產(chǎn)組Bcl-2低于對(duì)照組, Bax則高于對(duì)照組。說(shuō)明Bcl-2/Bax基因共同參與正常早孕期蛻膜細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié), 且處于一種正常的平衡狀態(tài)。Bax增高則細(xì)胞凋亡增加, Bax降低則細(xì)胞凋亡降低。細(xì)胞凋亡調(diào)控異常會(huì)導(dǎo)致習(xí)慣性流產(chǎn)以及多種妊娠并發(fā)疾病的發(fā)生, 這與丁峰等［4］在自然流產(chǎn)蛻膜組織中觀察的結(jié)果相類似。本次研究結(jié)果顯示：稽留流產(chǎn)組與正常妊娠組相比, Bcl-2/Bax比值降低, 比例平衡被打破, 細(xì)胞凋亡增加, 導(dǎo)致稽留流產(chǎn)結(jié)局。

綜上所述, 正常早孕階段細(xì)胞凋亡和修復(fù)、Bcl-2/Bax在胎盤(pán)絨毛組織中的表達(dá)處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài), 這種平衡對(duì)妊娠的順利進(jìn)行有重要作用。如果細(xì)胞凋亡指數(shù)增加、Bcl-2/Bax在胎盤(pán)絨毛組織中的表達(dá)失衡則會(huì)導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的發(fā)生。如果能夠進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)引起細(xì)胞異常凋亡的因素和機(jī)制, 發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致Bcl-2/Bax在胎盤(pán)絨毛組織中的表達(dá)失衡的原因, 進(jìn)而人為地控制這些因素或阻斷其作用途徑, 就能夠找到預(yù)防和治療復(fù)發(fā)性稽留流產(chǎn)的方法。

［1］ Dai D, Moulton BC, Oqle TF.Regression of the decidualized me sometrium and decidual cell apoptosis are associated with a shift in expression of Bcl-2 family members.Biol Reprod, 2000, 63(1):188-195.

［2］ 賀子秋,劉嵐,陶昱.自然流產(chǎn)絨毛與蛻膜組織中細(xì)胞凋亡的研究.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2010,31(3):38-40.

［3］ Minas Jeschek U, Kalantaridou SN.Abortion is associated with increased expression of FasL in decidual leukocytes and apoPtosis of extravillous trophoblasts:a role for CRH and uroco~in.Mol Hum Reprod, 2007,13(9):663-673.

［4］ 丁峰,傅國(guó)強(qiáng),邢福棋,等.自然流產(chǎn)中的早孕蛻膜細(xì)胞Bcl-2/ Bax比例異常.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2002,22(4):363-366.

Comparative study of Bax, Bcl-2 protein expression in villi structure during normal pregnancy and missed abortion

YANG Xing-shuang.Linyi Yishui Central Hospital, Linyi 276400, China

Objective To study apoptosis regulating proteins Bcl-2 and Bax in normal pregnancy and missed abortion villi structure and its significance, and explore the reasons for missed abortion.Methods Choose our hospital patients missed abortion and early pregnancy abortion patients, 60 cases in total, divided into group A and group B.Immediately after abortion, embryonic villi specimens sent to pathology.Light microscopy were applied in each group villi morphological changes in the structure, while applying immunohistochemical methods and computer image analysis system to detect Bax, Bcl-2 expression in each group villi and cell apoptosis.Results Missed abortion group trophoblast cell apoptosis index was (33.32±0.79)%, was significantly higher in group B(18.90±0.63)%, difference was statistically significant (P<0.01).Bax and Bcl-2 in the two groups syncytiotrophoblast cells show positive rate.In missed abortion group, Bax positive rate increased, Bcl-2 positive rate of decline, Bcl-2/Bax ratio increased, differences were statistically significant (P<0.01).Conclusion The increasing positive expression rate of Bax and the decreasing positive expression rate of Bcl-2 in decidua villi can lead to villous syncytiotrophoblast cells increased significantly,and further lead to missed abortion.

Bax protein; Bcl-2 protein; Placental villi; Missed abortion;Immunohistochemistry

276400 山東省臨沂市沂水中心醫(yī)院