嚴(yán)拯宇，劉新穎，王瑞，廖聲華

（中國藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京211198）

毛細(xì)管氣相色譜法測定甲磺酸伊馬替尼中殘留有機(jī)溶劑

嚴(yán)拯宇*，劉新穎，王瑞，廖聲華**

（中國藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京211198）

目的：建立可同時測定甲磺酸伊馬替尼原料藥中甲醇、乙醇和N′N-二甲基甲酰胺（DMF）等3種殘留有機(jī)溶劑的毛細(xì)管氣相色譜法。方法：采用WondaCAP WAX毛細(xì)管柱為色譜柱，程序升溫，N2為載氣，載氣流速為4.0 mL ? min-1，氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度為250 ℃，進(jìn)樣口溫度為200 ℃，進(jìn)樣量為1.0 μL。以正丁醇為內(nèi)標(biāo)，通過內(nèi)標(biāo)法計算樣品中3種有機(jī)溶劑殘留量。結(jié)果：甲醇、乙醇和DMF在所建立的色譜條件下均能完全分離，分別在2.94～44.11、4.91～73.68和0.084～12.60 mg ? L-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9940～0.9985），進(jìn)樣精密度（RSD）均小于5.0%（n=6），平均回收率為104.8%～105.8%（RSD＜5.0%，n=9），定量限分別為0.20、0.33和0.08 ng（信噪比為10∶1），檢測限分別為0.05、0.11和0.02 ng（信噪比為3∶1）。樣品中未檢出甲醇和DMF，乙醇含量低于有關(guān)限度規(guī)定。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可用于甲磺酸伊馬替尼原料藥中殘留有機(jī)溶劑的檢測。

毛細(xì)管氣相色譜法；甲磺酸伊馬替尼；殘留有機(jī)溶劑；甲醇；乙醇；N′N-二甲基甲酰胺

甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate，商品名：Glive，格列衛(wèi)）是由瑞士Novartis（諾華）公司研發(fā)的第1代酪氨酸激酶抑制劑，為全球首個獲批進(jìn)入臨床應(yīng)用的腫瘤發(fā)生相關(guān)信號傳導(dǎo)抑制劑[1]。其2001年5月首次在美國上市，用于治療急變期、加速期或a-干擾素治療失敗的慢性髓性白血?。–ML）患者，并于2002年2月又被批準(zhǔn)用于治療不能手術(shù)切除或轉(zhuǎn)移的成人惡性胃腸道間質(zhì)腫瘤(GIST)患者，2008年12月獲準(zhǔn)用于成人GIST患者腫瘤切除術(shù)后的輔助治療。此外，本品還被美國FDA批準(zhǔn)用于治療費(fèi)城染色體陽性的急性淋巴細(xì)胞白血病[2]。

甲磺酸伊馬替尼在其合成和精制過程中，使用了甲醇、乙醇和N′N-二甲基甲酰胺（DMF）等有機(jī)溶劑，這些溶劑對人體和環(huán)境都具有一定的潛在毒性。按照人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會( ICH) 頒布的Q3C殘留溶劑指導(dǎo)原則，DMF和甲醇為二類溶劑（應(yīng)限制的溶劑），二者限度分別為0.088%和0.3%，而乙醇為三類溶劑（低毒溶劑），限度為0.5%[3]。本文在參照中國藥典方法[4]及有關(guān)文獻(xiàn)的有機(jī)溶劑殘留測定方法[5-6]基礎(chǔ)上，建立毛細(xì)管氣相色譜法，同時測定甲磺酸伊馬替尼原料藥中甲醇、乙醇、DMF等殘留有機(jī)溶劑，并進(jìn)行方法學(xué)研究。

1 材料

1.1 儀器

GC-2014氣相色譜儀[配置氫火焰離子化檢測器（FID）]，GC solutions工作站（日本SHIMADZU公司）；BP211D 電子天平 (北京賽多利斯公司) 。

1.2 藥品和試劑

甲磺酸伊馬替尼原料藥(中國藥科大學(xué)醫(yī)化所提供，批號：20140703、20140705、20140707)；甲醇、乙醇、DMF 、正丁醇均為分析純，實(shí)驗用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：島津聚乙二醇毛細(xì)管柱WondaCAP WAX（30.0 m×530 μm×1.00 μm）；檢測器： FID；柱溫：初溫40 ℃（保持5 min），以30 ℃ · min-1升溫至220 ℃（保持4 min）；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；檢測器溫度：250 ℃；載氣：高純氮?dú)?；流速?.0 mL · min-1；分流比：5∶1；進(jìn)樣量：1.0 μL。

2.2 溶液制備

各溶劑儲備液的配制：取甲醇0.15 g、乙醇0.25 g和DMF 0.044 g，精密稱定，分別置于50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，即得甲醇、乙醇和DMF儲備液。

混合儲備液的配制：精密量取甲醇、乙醇和DMF儲備液各1 mL，置于10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，即可。

內(nèi)標(biāo)儲備液的配制：取正丁醇0.25 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加入水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即可。

混合對照溶液的配制：精密量取混合儲備液1 mL置于10 mL量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)儲備液1.0 mL后用水稀釋至刻度，搖勻，即可。

供試品溶液的配制：精密稱取甲磺酸伊馬替尼原料藥0.1 g置于10 mL量瓶中，加水適量溶解后，再精密加入內(nèi)標(biāo)儲備液1.0 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，即可。

2.3 各溶劑及內(nèi)標(biāo)的色譜定位

精密量取各溶劑及內(nèi)標(biāo)正丁醇的儲備液適量，按“2.1”項下色譜條件，分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，確定其保留時間。結(jié)果顯示，在該色譜條件下，甲醇、乙醇、DMF及正丁醇的保留時間分別為5.61、6.26、10.26及8.84 min。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

精密量取混合對照溶液和空白溶劑（水）1.0 μL，按“2.1”項下色譜條件，分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（見圖1A、1B）。結(jié)果表明，混合對照溶液中各溶劑及正丁醇的理論塔板數(shù)均大于5 000 ，各相鄰峰的分離度均大于1.5，均能完全分離，且溶劑水不干擾測定。

圖1 混合對照溶液(A)和空白溶劑(B)的色譜圖Figure 1 Chromatograms of mixed reference solution(A) and blank solvent (B)

2.5 線性考察

分別精密量取混合儲備液0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL于10 mL 量瓶中，各加入內(nèi)標(biāo)儲備液1.0 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，作為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取各標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.0 μL，進(jìn)樣，記錄色譜圖。分別以混合儲備液中各溶劑與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值 (A)與相應(yīng)質(zhì)量濃度(C，mg · L-1) 進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表 1 3種溶劑的回歸方程與線性范圍（n=6）Table 1 regression equations and linear ranges of 3 solvents

2.6 進(jìn)樣精密度與重復(fù)性考察

取“2.5” 項下制備的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中5號溶液，精密量取1.0 μL，連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄色譜圖。結(jié)果測得，甲醇、乙醇和DMF與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值的RSD分別為1.3 % 、1.0 % 和3.8 %(n=6) 。表明，該方法進(jìn)樣精密度良好。另取甲磺酸伊馬替尼原料藥(批號：20140705)6份，按“2.2”項下方法，制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法計算3種有機(jī)溶劑殘留量。結(jié)果，供試品中未檢出甲醇和DMF，乙醇平均含量為0.200 2%（RSD=2.8%，n=6）。

2.7 定量限和檢測限考察

取各溶劑儲備液適量，用水逐級稀釋后，精密量取1.0 μL，進(jìn)樣測定。結(jié)果，按信噪比為10∶1，測得甲醇、乙醇和DMF的定量限分別為0.20、0.33和0.08 ng；按信噪比為3∶1，測得甲醇、乙醇和DMF的檢測限分別為0.05、0.11和0.02 ng。

2.8 回收率試驗

取甲磺酸伊馬替原料藥(批號：20140705)0.1 g若干份，精密稱定，置10 mL量瓶中，再分別加入80%、100%和120%限量濃度的各溶劑，加入適量內(nèi)標(biāo)儲備液，配制低、中、高3個溶劑濃度水平的供試品溶液，每個溶劑濃度配制3份，進(jìn)樣，記錄色譜圖，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 3種溶劑的回收率試驗結(jié)果Table 2 Results of recovery test of 3 solvents

2.9 穩(wěn)定性考察

按“2.2”項下方法新鮮配制混合對照溶液，分別于0、2、4、6、10 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果測得，甲醇、乙醇和DMF與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值的RSD分別為1.3%、0.86%和3.3%。

2.10 耐用性考察

在其他色譜條件不變的情況下，分別調(diào)整檢測器溫度為245和255 ℃，進(jìn)樣口溫度為195和205 ℃，初始柱溫為35和45 ℃，載氣流速為3.8和4.2 mL · min-1，再對混合對照溶液進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇、乙醇、DMF和正丁醇的分離度和理論塔板數(shù)均能滿足系統(tǒng)適用性試驗的要求。

2.11 樣品測定

取3批次甲磺酸伊馬替尼原料藥各0.1 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法計算各有機(jī)溶劑的殘留量。結(jié)果，3批次原料藥中均未檢出甲醇和DMF，乙醇含量均低于《中國藥典》和ICH的有關(guān)限度規(guī)定（見表3）。

表33 批次樣品中有機(jī)溶劑殘留量檢查結(jié)果Table 3 Determination results of organic solvent residues in the three batches of samples

3 討論

3.1 溶解介質(zhì)的選擇

由于甲磺酸伊馬替尼原料藥樣品及3種有機(jī)溶劑均能溶于水中，且水沸點(diǎn)較低，F(xiàn)ID檢測器對其幾乎不響應(yīng)，故避開了溶解介質(zhì)對各組分測定的干擾。因此，本文選用水作為溶解介質(zhì)。

3.2 色譜柱的選擇

在色譜實(shí)驗過程中，筆者比較了2種不同極性的色譜柱——中等極性的50%苯基-50%二甲基聚硅氧烷毛細(xì)管柱Wonda CAP17和強(qiáng)極性的聚乙二醇毛細(xì)管柱Wonda CAP WAX，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)極性柱對甲醇和乙醇峰的分離度優(yōu)于中等極性柱，且峰形較好。所以，確定選用聚乙二醇毛細(xì)管柱(30.0 m ×530 μm×1.00 μm) 對甲磺酸伊馬替尼中殘留溶劑進(jìn)行檢測。

3.3 色譜條件的確定

在柱溫選擇方面，優(yōu)先考慮保證各溶劑的有效分離，在此前提下，采用程序升溫的方式，可縮短分析時間，提高檢測效率；而且，考慮到甲醇和乙醇均為低沸點(diǎn)溶劑，且沸點(diǎn)較為相近，故將初始柱溫定為40 ℃，維持5 min，使兩溶劑峰完全分離，然后再以30 ℃ · min-1升溫至 220 ℃，維持4 min，使DMF盡快出峰，結(jié)果各溶劑峰達(dá)到有效分離。

4 結(jié)論

本文建立的毛細(xì)管氣相色譜法可用于檢測甲磺酸伊馬替尼原料藥中3種殘留溶劑，確保原料藥的安全性，完善了甲磺酸伊馬替尼的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。本法檢測速度快、靈敏，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可滿足甲磺酸伊馬替尼原料藥質(zhì)量控制的檢測要求。

[1]孫忠實(shí), 朱珠, 韓風(fēng)英. 酪氨酸激酶抑制劑——伊馬替尼[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2003, 38(1): 69-71.

[2]丁倩倩, 陳勤奮. 甲磺酸伊馬替尼的臨床應(yīng)用[J]. 上海醫(yī)藥, 2013, 34(3): 5-8.

[3]人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會. 殘留溶劑指導(dǎo)原則[[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2000: 236.

[4]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(二部)[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 附錄ⅧP.

[5]馮敏, 王淼, 王曦, 等. GC法同時測定西尼地平原料藥中甲醇等5種溶劑的殘留量[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報, 2014, 31(6): 459-462.

[6]單曉輝, 王偉, 嚴(yán)拯宇. 程序升溫毛細(xì)管氣相色譜法測定鹽酸氨溴索的溶劑殘留量[J]. 海峽藥學(xué), 2010, 22 (2): 43-45.

Determination of Residual Organic Solvents in Imatinib Mesylate by Capillary GC

YAN Zhengyu, LIU Xinying ,WANG Rui, LIAO Shenghua

( School of Science, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China)

Objective: To establish a capillary GC method for simultaneous determination of methanol, ethanol and N,N-dimethylformamide(DMF) as residual organic solvents in imatinib mesylate API. Methods: WondaCAP WAX capillary column with temperature programming, nitrogen as carrier gas at a fow rate of 4.0 mL ? min-1and FID at 250 ℃ were used with an injection port temperature of 200 ℃ and an injection volume of 1.0 μL. With n-butyl alcohol as internal standard, three kinds of organic solvent residues in the samples were calculated by internal standard method. Results: Methanol, ethanol and DMF were completely separated under the established chromatographic condition. Good linearities were obtained in corresponding concentration ranges of 2.94-44.11 mg ? L-1(methanol), 4.91-73.68 mg ? L-1(ethanol ) and 0.084-12.60 mg ? L-1(DMF), with correlation coeffcients of 0.9940-0.9985. The sampling precisions (RSDs) were less than 5.0%(n=6). The average recovery rates were 104.8%-105.8%(RSD＜5%, n=9). The limits of quantifcation for them were 0.20, 0.33 and 0.08 ng respectively( S/N=10:1). The limits of detection for them were 0.05, 0.11and 0.02 ng respectively(S/N=3:1). Methanol and DMF were not detected and ethanol contents were below the limit of regulation in the samples. Conclusion: The method is simple, accurate, sensitive and repeatable. It is suitable for the determination of the residual organic solvents in imatinib mesylate API.

capillary GC; imatinib mesylate; residual organic solvents; methanol; ethanol; N,N-dimethylformamide

R927.11

B

1001-5094（2014）10-0761-04

接受日期：2014-09-27

項目資助：江蘇省普通高校學(xué)術(shù)學(xué)位研究生科研創(chuàng)新計劃項目（No. KYZZ_0185）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（No. 201210316099）

*通訊作者：嚴(yán)拯宇，教授；

研究方向：儀器分析；

Tel：025-86185150； E-mail：yanzhengyujiang@hotmail.com

**通訊作者：廖聲華，講師；

研究方向：藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究；

Tel：025-86185150； E-mail：liaoshenghuacpu@hotmail.com