付莉莉+譚德冠+韓冰瑩+孫雪飄+張家明

摘要：原生質(zhì)體技術(shù)是細胞工程的核心部分，是進行作物改良和種質(zhì)創(chuàng)新的重要方法?；外植體來源及預處理?；酶液組成和濃度?；酶解時間?；酶液滲透壓?；培養(yǎng)基組成?；培養(yǎng)方法?；培養(yǎng)密度等對原生質(zhì)體培養(yǎng)均有很大影響?；對影響木薯（Manihot esculenta Crantz.）原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株的相關因素進行了綜合分析，探討了原生質(zhì)體培養(yǎng)在植物育種上的應用潛力?；

關鍵詞：木薯（Manihot esculenta Crantz.）；原生質(zhì)體；培養(yǎng)

中圖分類號：S889+5；Q242文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2014）11-2679-03

Factors affecting Protoplast Culture of Cassava

FU Li-li，TAN De-guan，HAN Bing-ying，SUN Xue-piao，ZHANG Jia-ming

（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture， Haikou 571101，China）

Abstract： Protoplast technology， the core of cell engineering， is the important method of crop improvement and germplasm innovation. Source and pretreatment of explant， solution composition and concentration of enzyme， enzymatic duration，osmotic pressure of enzyme solution， composition of the medium， culture methods， culture density and other factors had a great influence on protoplast culture. The factors affecting plant regeneration from protoplast of cassava（Manihot esculenta Crantz.） were analysized comprehensively. The potential of apply protoplast culture in plant breeding were discussed.

Key words： cassava（Manihot esculenta Crantz.）；protoplast；culture

基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目（2010CB126602）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（ITBB110501）；海南省重大科技項目子課題熱帶生物種質(zhì)與基因資源研究（ZDZX2013023-1）

植物原生質(zhì)體是去除了細胞壁的裸露細胞，是遺傳改良的重要試驗體系之一，可應用于無性雜交?；遺傳轉(zhuǎn)化和細胞生理學等領域[1，2]?；1968年，Takebe等[3]第一個采用商品酶分離得到煙草葉肉原生質(zhì)體，并于1971年成功再生成植株?；目前，植物原生質(zhì)體的研究取得了較快發(fā)展，大蒜[4]?；天竺葵[5]?；棉花[6]?；柑橘[7]等的原生質(zhì)體培養(yǎng)均已獲得成功?；而對木薯（Manihot esculenta Crantz.）而言，其原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株很難，有關于木薯原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)的報道較少[8-12]，至今未建立系統(tǒng)?；成熟的原生質(zhì)體培養(yǎng)體系?；已有研究表明，影響木薯原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素較多且復雜[11]?；為充分掌握原生質(zhì)體培養(yǎng)的規(guī)律，提高其植株再生頻率，本研究從木薯原生質(zhì)體分離?；純化?；培養(yǎng)等方面入手，研究影響木薯原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素，以期為建立合理?；操作性強的木薯原生質(zhì)體培養(yǎng)體系提供理論依據(jù)，為開展木薯遺傳改良和創(chuàng)造新種質(zhì)提供技術(shù)和材料?；

1外植體來源及預處理

1.1材料來源

生長旺盛?；生命力強的組織和細胞是獲得高活力原生質(zhì)體的關鍵，并影響原生質(zhì)體的培養(yǎng)及植株再生?；用于原生質(zhì)體分離的較好的外植體有葉片?；根?；子葉?；胚?；愈傷組織及懸浮培養(yǎng)物等，尤其是葉片，因為以葉片作材料不僅取材方便，可以分離出大量均勻一致的細胞，而且葉肉細胞排列疏松，易于去除細胞壁?；目前有關報道中，用于木薯原生質(zhì)體分離的材料主要是脆性胚性愈傷組織和葉片[8-12]?；

1.2材料預處理

酶解前對材料進行預處理將有利于原生質(zhì)體的分離，提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性?；Wallin等[13]將蘋果葉片放入附加5% PVP和0.5 mmol/L蛋氨酸的W5鹽-糖溶液中進行處理?；分離，提高了原生質(zhì)體的產(chǎn)量；Nyman等[14]將草莓試管苗暗培養(yǎng)1周，提高了分離出的原生質(zhì)體的產(chǎn)量?；同時，預處理時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力影響也較大?；用于分離原生質(zhì)體的木薯脆性胚性愈傷組織無需預處理可直接酶解?；而對于木薯葉片而言，從原生質(zhì)體產(chǎn)量?；活力和細胞破碎等方面綜合考慮，葉片放入CPW-9M溶液中預處理的最佳時間為0.5～1.0 h[9，11]?；

2原生質(zhì)體分離

高質(zhì)量的原生質(zhì)體是再生植株的關鍵?；研究認為，胞質(zhì)濃?；不透明?；大小均勻?；呈圓球狀的裸露細胞是高質(zhì)量的原生質(zhì)體?；原生質(zhì)體分離的方法主要有兩種：①機械法?；1892年Klercker首次采用該方法分離植物原生質(zhì)體，排除了外源酶對原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)和代謝活性的有害影響，但產(chǎn)量較低，因此目前該法使用較少；②酶解法?；采用不同種類和濃度的酶處理細胞，將細胞壁解離以獲得原生質(zhì)體的方法，可獲得大量活力高的原生質(zhì)體?；因此，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力與酶液組成和濃度?；酶液滲透壓?；酶解時間等有著密切關系?；

2.1酶液組成和濃度

用于分離植物原生質(zhì)體的酶主要有纖維素酶?；半纖維素酶?；果膠酶和離析酶等?；實踐證明，酶液中各種酶的濃度和比例對木薯原生質(zhì)體的解離效果具有較大的影響?；酶液濃度過高或過低均不利于原生質(zhì)體的解離，所以應選擇合適的酶液組成與濃度?；以華南8號木薯為例，木薯葉片原生質(zhì)體分離適宜的酶液組合為1%纖維素酶+0.5%離析酶+1%半纖維素酶[11]，而文峰等[12]分離木薯TMS60444愈傷組織采用的酶液組合為1%纖維素酶+0.04%離析酶+0.01%果膠酶?；

2.2酶解時間

酶解處理一般在25 ℃左右?；黑暗條件下進行，通常采用混合酶液一步完成?；酶解時間從幾個小時至幾十個小時，依照不同植物和不同外植體而定?；酶解時間過長對原生質(zhì)體有傷害，從而影響其產(chǎn)量和活力，而酶解時間過短的話，不能獲得足夠多的原生質(zhì)體而滿足不了試驗需要?；因此，為了獲得大量具有活力的木薯葉肉原生質(zhì)體，酶解時間一般以14～16 h為宜?；酶解木薯胚性愈傷組織，時間則長達18 h?；

2.3酶液滲透壓

因為沒有了細胞壁，原生質(zhì)體對外界環(huán)境的滲透壓較為敏感，酶液的滲透壓和原生質(zhì)體滲透壓相差大，會導致原生質(zhì)體膨脹或收縮而死亡?；因此，酶液應保持一定的滲透壓?；常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑有糖或糖醇（葡萄糖?；蔗糖?；山梨醇?；甘露醇等）?；此外，鹽溶液也可能起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用?；木薯中采用甘露醇（9%）作為滲透壓穩(wěn)定劑?；

3原生質(zhì)體培養(yǎng)

3.1培養(yǎng)基

原生質(zhì)體培養(yǎng)基為原生質(zhì)體的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，影響原生質(zhì)體再生?；不同作物的培養(yǎng)基不盡相同，同一作物基因型不同其培養(yǎng)基也可能不同?；培養(yǎng)基的種類直接影響到原生質(zhì)體的分裂頻率?；植板率及愈傷組織的出現(xiàn)等?；原生質(zhì)體培養(yǎng)最常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基?；B5培養(yǎng)基和KM8p培養(yǎng)基等?；培養(yǎng)基中的無機鹽?；碳源?；滲透劑和激素在原生質(zhì)體培養(yǎng)中起重要作用?；因此，在配制培養(yǎng)基時需要不斷對各種元素進行調(diào)整，以利于原生質(zhì)體的培養(yǎng)和植株再生?；目前報道中用于木薯原生質(zhì)體培養(yǎng)的培養(yǎng)基不盡相同，MS?；KM8p?；TM2G等均可用于木薯原生質(zhì)體培養(yǎng)?；

3.2培養(yǎng)方法

原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法較多，大多數(shù)與細胞培養(yǎng)相似?；主要培養(yǎng)方法有3種，即液體淺層培養(yǎng)法?；固體培養(yǎng)法?；固液雙層培養(yǎng)法?；①液體淺層培養(yǎng)法是目前較常用的原生質(zhì)體培養(yǎng)方法，是將原生質(zhì)體純化后，懸浮于液體培養(yǎng)基中，取少量平鋪于培養(yǎng)皿底部，然后封口培養(yǎng)，一般適用于容易分裂的原生質(zhì)體?；此方法的特點是操作簡單?；易于添加培養(yǎng)液，但容易使原生質(zhì)體發(fā)生粘連，難于定點觀察?；②固體培養(yǎng)法也稱為包埋培養(yǎng)法，是將原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基后，與凝固劑（如低熔點瓊脂糖）按一定比例混合，在培養(yǎng)皿底部形成一個薄層，凝固后封口培養(yǎng)?；此方法可有效阻止原生質(zhì)體的粘連，可以定點跟蹤和觀察原生質(zhì)體，但培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)不流動，不利于原生質(zhì)體吸收營養(yǎng)，且原生質(zhì)體生長過程中釋放出的有毒物質(zhì)不易擴散，而使細胞死亡?；③固液雙層培養(yǎng)法是在培養(yǎng)皿底部先平鋪一個薄層固體培養(yǎng)基，凝固后再在其上進行液體淺層培養(yǎng)，結(jié)合了液體淺層培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法的優(yōu)點?；固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可釋放到液體培養(yǎng)基中供原生質(zhì)體吸收，同時又可吸收液體培養(yǎng)基中細胞釋放的有害物質(zhì)?；在此基礎上還研究了其他方法，如懸滴培養(yǎng)法?；看護培養(yǎng)法?；飼養(yǎng)層培養(yǎng)法等?；木薯原生質(zhì)體培養(yǎng)目前采用的方法主要為液體淺層培養(yǎng)法[12]?；

3.3培養(yǎng)密度

原生質(zhì)體培養(yǎng)密度對其生長影響很大?；原生質(zhì)體培養(yǎng)密度一般在1×104～5×106 個/mL時，植物原生質(zhì)體才能正常分裂與發(fā)育?；密度過高時，會因為營養(yǎng)不足或有毒物質(zhì)過多而妨礙細胞的正常生長；密度過低時，則會因為濃度達不到培養(yǎng)條件而使細胞不能持續(xù)分裂?；木薯原生質(zhì)體培養(yǎng)密度一般在 5×105 個/mL左右?；

3.4其他因素

除了以上這些因素，光照條件?；溫度條件?；pH等對原生質(zhì)體的分裂?；生長和發(fā)育都有重要影響?；早期，原生質(zhì)體培養(yǎng)在黑暗條件下進行培養(yǎng)，是因為強光易引起細胞膜發(fā)生光氧化反應而損傷；當原生質(zhì)體再生成愈傷組織時，則將愈傷組織轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)?；原生質(zhì)體培養(yǎng)溫度一般控制在25～28 ℃，pH在5.8左右?；木薯原生質(zhì)體培養(yǎng)也不例外?；

4討論

原生質(zhì)體在細胞生物學?；生理學?；遺傳學和育種學等領域得到了廣泛的應用，通過原生質(zhì)體獲得再生植株的植物種類也越來越多?；但木薯原生質(zhì)體培養(yǎng)是一項復雜的工程，除了參考已有文獻進行研究外，還得考慮外界環(huán)境條件等綜合分析木薯原生質(zhì)體植株再生的因素，力求為木薯原生質(zhì)體再生植株提供較為理想的分離和培養(yǎng)條件?；木薯原生質(zhì)體培養(yǎng)的成功將為原生質(zhì)體融合以及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等奠定基礎，為細胞工程和基因工程開辟廣闊的應用前景?；

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