嚴(yán)育忠，范惠清，鄭文龍，楊煥章，陸燕春，石 毅

(上海市浦東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201300)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一種醫(yī)院感染的重要條件致病菌。近年來(lái)產(chǎn)金屬酶PA在我國(guó)呈廣泛播散的趨勢(shì)，廣泛耐藥PA感染率逐年增多[1]，產(chǎn)金屬酶PA感染患者的死亡率也在逐年上升[2]。因此及時(shí)檢測(cè)產(chǎn)金屬酶PA對(duì)合理使用抗菌藥物及控制病原菌播散非常重要[3-5]。乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)是一種應(yīng)用比較普遍的金屬酶抑制劑，但其是通過(guò)膜滲透作用來(lái)增加細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。因此目前普遍采用的紙片增效試驗(yàn)出現(xiàn)了較高的假陽(yáng)性率[6-7]。我們將這一方法進(jìn)行改良，先提取待測(cè)菌株酶液，去除了菌膜的影響因素。在試管內(nèi)預(yù)先將EDTA和酶液進(jìn)行反應(yīng)，以大腸埃希菌(ATCC 25922)為指示菌，觀察亞胺培南-EDTA紙片增效試驗(yàn)檢測(cè)金屬酶表型的效率。

材料和方法

一、材料

1.試驗(yàn)菌株和質(zhì)控菌株 (1)試驗(yàn)菌株:收集2010年1至12月上海市浦東醫(yī)院臨床分離的對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物(亞胺培南和/或美羅培南)耐藥PA 95株，試驗(yàn)前所有菌株經(jīng)Vitek 2 Compact全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)重新鑒定;(2)質(zhì)控菌株:大腸埃希菌(ATCC 25922)，PA(ATCC 27853)。

2.抗菌藥物及標(biāo)準(zhǔn)品 藥物敏感性紙片[亞胺培南(10 μg)紙片和美羅培南(10 μg)紙片]購(gòu)于英國(guó)Oxoid公司，亞胺培南粉劑為杭州默沙東制藥有限公司商品，美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品為衛(wèi)生部中國(guó)生物制品藥品鑒定所標(biāo)準(zhǔn)品。

3.試劑及儀器 EDTA為Sigma公司商品，Vitek 2 Compact全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司)、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(日本TaKaRa公司)、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIORAD公司)和加熱儀等。引物由上海生工生物工程有限公司合成，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

二、方法

1.藥物敏感性測(cè)定 采用瓊脂稀釋法測(cè)定所有菌株對(duì)亞胺培南、美羅培南和厄他培南的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations，MIC)值，濃度范圍為 0.125 ～128 μg/mL，試驗(yàn)操作與結(jié)果判斷均按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行。

2.EDTA紙片增效試驗(yàn)檢測(cè)金屬酶 (1)常規(guī)方法:參考文獻(xiàn)[9]，以0.5麥?zhǔn)蠁挝淮龣z菌菌液均勻涂布在水解酪蛋白胨瓊脂平板，中間貼亞胺培南藥物紙片2張，其中一張亞胺培南藥物紙片上加0.1 mmol/L EDTA 溶液 10 μL，紙片間距＞4 cm，35℃過(guò)夜培養(yǎng)，結(jié)果以△=d(亞胺培南+EDTA)-d(亞胺培南)≥5 mm為陽(yáng)性;(2)改良法:①酶液制備，將待檢菌株接種在水解酪蛋白胨肉湯中增菌，離心收集細(xì)菌，用0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液沖洗后制成一定濃度的細(xì)菌液，再用凍融法(-70℃快速冷凍和37℃水浴快速解凍，反復(fù)5次)破碎菌細(xì)胞，使其菌體內(nèi)的酶釋放出來(lái)，再離心(22000×g，1 h)去除細(xì)菌碎片，收集上清液即為酶液粗提物;②反應(yīng)液制備，上述酶液和EDTA以4∶1的比例制備，以0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏拇竽c埃希菌(ATCC 25922)菌液均勻涂布于水解酪蛋白胨平板，分別貼亞胺培南、亞胺培南+EDTA(10 μL)、亞胺培南 + 酶液(10 μL)和亞胺培南+反應(yīng)液(10 μL)4張紙片，紙片間距＞4 cm，35℃過(guò)夜培養(yǎng)，亞胺培南和亞胺培南+EDTA 2張紙片為空白對(duì)照，結(jié)果判斷以△=d(亞胺培南+反應(yīng)液)-d(亞胺培南+酶液)≥5 mm為陽(yáng)性。

3.PCR擴(kuò)增 煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，擴(kuò)增 IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2、SIM-1、SPM-1、GIM共7組金屬酶基因，所需的引物序列和PCR反應(yīng)條件均按參考文獻(xiàn)[10-11]進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序，結(jié)果在GenBank上查詢。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果用WHONET5.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以PCR檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，以敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值評(píng)估2種紙片增效試驗(yàn)檢測(cè)金屬酶的效果。

結(jié) 果

一、藥物敏感性試驗(yàn)

95株P(guān)A對(duì)亞胺培南和美羅培南的MIC值分別為 8 ～ ＞128 μg/mL 和 0.125 ～ ＞128 μg/mL。亞胺培南的耐藥率為100.0%(95/95)，美羅培南的耐藥率、中介率和敏感率分別為71.6%(68/95)、2.1%(2/95)和 26.3%(25/95)。其中，有68株亞胺培南和美羅培南均表現(xiàn)為耐藥，25株亞胺培南耐藥而美羅培南敏感，2株為亞胺培南耐藥而美羅培南中介。見(jiàn)表1。

表1 95株受試菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的藥物敏感性分析

二、PCR擴(kuò)增金屬酶基因及DNA測(cè)序結(jié)果

PCR擴(kuò)增檢出8株金屬酶基因陽(yáng)性菌株，占95株碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物不敏感PA菌株的8.4%。DNA測(cè)序結(jié)果顯示，7株含IMP-9型基因，1株含VIM-2型基因。

三、常規(guī)及改良亞胺培南-EDTA紙片增效試驗(yàn)結(jié)果比較

常規(guī)法8株產(chǎn)金屬酶菌株均顯示陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)有3株不產(chǎn)金屬酶菌株顯示陽(yáng)性結(jié)果;改良法與PCR結(jié)果均一致，見(jiàn)表2。改良后亞胺培南-EDTA紙片增效試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。其中在圖1(b)中，金屬酶陰性PA菌株改良法呈陰性結(jié)果，值得指出的是在部分菌株的試驗(yàn)中，含酶液的紙片抑菌圈比不含酶液的紙片抑菌圈小，原因有待進(jìn)一步研究。

表2 95株受試菌PCR結(jié)果與常規(guī)法及改良法的比較

圖1 改良后的亞胺培南-EDTA紙片增效試驗(yàn)結(jié)果

四、方法學(xué)分析

亞胺培南-EDTA紙片增效試驗(yàn)常規(guī)法和改良法的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值見(jiàn)表3。

表3 常規(guī)法與改良法的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分析 (%)

討 論

上世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)產(chǎn)金屬酶PA，金屬酶基因常位于Ⅰ類(lèi)整合子和質(zhì)粒等遺傳物質(zhì)上，可發(fā)生水平傳播[3，12-13]。由于碳青霉烯類(lèi)藥物被認(rèn)為是目前抗革蘭陰性桿菌的最后一道防線，細(xì)菌產(chǎn)金屬酶往往會(huì)對(duì)此類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥，因此對(duì)于金屬酶的檢測(cè)有利于感染的治療和控制[14]。

PA對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥除因產(chǎn)金屬酶外，其他因素如0prD2膜蛋白缺失或減少、泵出機(jī)制MexAB-0prM的高表達(dá)也可使PA對(duì)不同碳青霉烯類(lèi)藥物表現(xiàn)出不同的耐藥性。本研究中95株耐碳青霉烯類(lèi)藥物PA對(duì)亞胺培南的耐藥率明顯高于美羅培南，與文獻(xiàn)報(bào)道[15]一致，主要原因可能是0prD2蛋白的缺失或減少所致。他們對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥結(jié)果以二者均耐藥和前者耐藥后者敏感2種模式為主，而8株產(chǎn)酶菌株為均耐藥模式。25株表現(xiàn)為亞胺培南耐藥而美羅培南敏感模式的菌株經(jīng)金屬酶基因PCR擴(kuò)增后結(jié)果均顯示陰性。

目前國(guó)內(nèi)耐碳青霉烯類(lèi)藥物PA產(chǎn)金屬酶比例在10%左右[16]。本研究對(duì)95株耐碳青霉烯類(lèi)藥物PA進(jìn)行PCR檢測(cè)金屬酶基因，結(jié)果陽(yáng)性率為8.4%。金屬酶具有碳青霉烯酶及依賴金屬的特性，改良Hodge試驗(yàn)僅針對(duì)碳青霉烯酶水解活性，CLSI文件不推薦對(duì)PA進(jìn)行金屬酶的檢測(cè)。由于E-test成本昂貴，PCR技術(shù)要求較高，使得E-test和PCR均不適合作為常規(guī)試驗(yàn)。EDTA因獲取容易、價(jià)格低廉是實(shí)驗(yàn)室常用的金屬酶抑制劑，EDTA的紙片增效試驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果易讀的特點(diǎn)。然而常規(guī)的紙片增效試驗(yàn)中，EDTA一方面因抑制待測(cè)菌株的生長(zhǎng)可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，而且 EDTA 濃度越高假陽(yáng)性率越高[9，17-18];另一方面因增強(qiáng)了細(xì)菌膜通透性，細(xì)菌對(duì)抗菌藥物敏感性的增加也可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果[6-7]。因此我們對(duì)常規(guī)的試驗(yàn)方法進(jìn)行了改良，通過(guò)提取受試菌酶液，預(yù)先將酶液和EDTA在試管內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，同時(shí)反應(yīng)液中EDTA的相對(duì)用量也比常規(guī)法少，使得EDTA對(duì)試驗(yàn)的影響明顯下降。在常規(guī)試驗(yàn)中，3株假陽(yáng)性菌株采用改良試驗(yàn)均顯示陰性結(jié)果。我們推測(cè)在目前PA對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥性主要受膜蛋白影響的情況下，常規(guī)試驗(yàn)的假陽(yáng)性率可能會(huì)比較高，有文獻(xiàn)報(bào)道耐碳青霉烯類(lèi)藥物PA菌株常規(guī)試驗(yàn)陽(yáng)性，對(duì)金屬酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性[19]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)改良后的亞胺培南-EDTA紙片增效試驗(yàn)對(duì)耐碳青霉烯類(lèi)藥物的PA金屬酶的檢測(cè)敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均為100.0%，取得了非常好的效果。

綜上所述，改良后的亞胺培南-EDTA紙片增效試驗(yàn)較常規(guī)法檢測(cè)效果更好，但本研究菌種及標(biāo)本數(shù)量有限，金屬酶也僅包括了亞胺培南和美羅培南2種，尚需擴(kuò)大標(biāo)本量進(jìn)一步研究。

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