劉 超，潘曉艷，朱慧娟，袁夢丹，蔡紅陽，孫 莉

（大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

0 引言

海馬是應(yīng)激領(lǐng)域研究的一個重點，有研究表明慢性應(yīng)激可以損傷海馬神經(jīng)元[1-3]。其損傷機(jī)制可能是在應(yīng)激狀態(tài)下，下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸持續(xù)激活，引起血漿糖皮質(zhì)激素（GC）釋放增多，作用于海馬區(qū)GC受體，導(dǎo)致海馬CA3區(qū)神經(jīng)元發(fā)生萎縮、甚至死亡[4]。前期研究顯示中藥加味保元湯具有抗應(yīng)激作用[5-7]，本實驗采用慢性束縛應(yīng)激大鼠模型，進(jìn)一步觀察加味保元湯對慢性束縛應(yīng)激大鼠海馬 CA3區(qū)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，以探索加味保元湯抗應(yīng)激作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組及處理

健康雄性SD大鼠30只，體重180～220g，清潔級，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)等分為5組：正常對照組、模型組、加味保元湯高劑量組、加味保元湯中劑量組和加味保元湯低劑量組。

1.1.2 實驗儀器與試劑

顯微攝像機(jī)：OLYMPUS-BX63；石蠟切片機(jī)：LEICA RM2255。

加味保元湯由人參、黃芪、肉桂、甘草、五味子分別以5：6：5：3：5比例構(gòu)成，水提取物由本校中藥研究室制備。

1.2 方法

1.2.1 應(yīng)激模型制作

正常對照組，不給予任何刺激，其它各組大鼠每日束縛 1次，每日開始時間及束縛時間不同，第 1天為4 h，其后每次增加30～60 min，連續(xù)3周。束縛期間禁食水。加味保元湯高、中、低劑量組束縛前分別給予300 mg/kg體重、200 mg/kg體重和100 mg/kg體重加味保元湯水提取物灌胃；模型組，給予束縛制動刺激不給予中藥，但束縛前給予等量生理鹽水灌胃；正常對照組，不給予任何刺激，但以等量生理鹽水灌胃。

1.2.2 蘇木素-伊紅染色

光鏡下觀察各組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)、結(jié)構(gòu)：實驗結(jié)束后，各組大鼠分別用 10%水合氯醛0.4 g/kg體重腹腔注射麻醉，先后用冷生理鹽水和4%多聚甲醛主動脈灌流固定，繼之剝?nèi)∧X塊在4%多聚甲醛固定過夜，然后乙醇脫水，二甲苯滲透透明，石蠟包埋切片，片厚5 μm。蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封固。然后光鏡下觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化，并拍攝圖片。

2 結(jié)果

海馬CA3區(qū)神經(jīng)元，正常對照組：錐體細(xì)胞排列整齊、密集，細(xì)胞有光暈，胞體呈橢圓形，胞膜完整，胞質(zhì)均勻透亮，核膜清楚，胞核清晰；模型組細(xì)胞排列稀疏,錐體細(xì)胞數(shù)明顯減少，胞體膨脹，胞膜不完整，胞質(zhì)不均勻，核膜不清，胞核固縮；加味保元湯中劑量組錐體細(xì)胞排列較整齊、較密集，細(xì)胞有光暈，胞膜較完整，胞體呈橢圓形，胞質(zhì)較均勻，胞膜較完整，核膜較清，胞核較清晰，與正常組比較接近；加味保元湯高、低劑量組錐體細(xì)胞排列稀疏,錐體細(xì)胞數(shù)減少，胞體膨脹，胞膜不完整，胞質(zhì)不均勻，核膜不清，胞核固縮。以上結(jié)果說明束縛應(yīng)激對大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元有明顯損傷，中劑量加味保元湯對其損傷有明顯保護(hù)作用。CA1區(qū)無明顯變化，結(jié)果見圖1-圖5：

圖1 正常對照組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元×200

圖2 模型組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元×200

圖3 加味保元湯高劑量組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元×200

圖4 加味保元湯中劑量組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元×200

圖5 加味保元湯低劑量組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元×200

3 討論

應(yīng)激是指機(jī)體對內(nèi)外環(huán)境刺激因素所做出的適應(yīng)性反應(yīng)。過度應(yīng)激可引起機(jī)體下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸持續(xù)激活，下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRF)釋放增多，進(jìn)而促使垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)釋放，ACTH作用于腎上腺皮質(zhì)，引起 GC釋放增多，從而引起神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，并造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和功能紊亂。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，海馬是與認(rèn)知行為功能密切相關(guān)的重要腦區(qū)，由于富含 GC受體，而且是中樞GC受體含量最高的腦區(qū)，所以應(yīng)激時，海馬區(qū)極易選擇性地受到高濃度GC的攻擊，導(dǎo)致海馬器質(zhì)性損害[4]。

已有研究表明慢性應(yīng)激可以損傷海馬神經(jīng)元[1-3]。且研究顯示慢性束縛應(yīng)激主要使大鼠海馬CA3區(qū)在形態(tài)、結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)一系列損害：錐體細(xì)胞數(shù)減少，頂樹突縮短，電鏡下細(xì)胞核固縮，核膜皺縮，線粒體脊模糊，空泡樣變性，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)模糊不清等，而不發(fā)生在 CA1區(qū)[8]。本實驗結(jié)果也清楚地顯示模型組大鼠海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列稀疏，錐體細(xì)胞數(shù)減少，胞體膨脹，胞膜不完整，胞質(zhì)不均勻，核膜不清，胞核固縮；CA1區(qū)無明顯變化，與文獻(xiàn)資料相符合。

慢性應(yīng)激致海馬損傷的機(jī)制尚不十分清楚，目前許多研究者認(rèn)為高糖皮質(zhì)激素（GC）血癥可能是其中的主要原因[2,9-10]。Magarios等研究發(fā)現(xiàn)長期暴露于高水平皮質(zhì)酮條件下會導(dǎo)致大鼠海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞減少，原因之一是皮質(zhì)酮可能通過對大鼠海馬神經(jīng)元受體的作用影響神經(jīng)元的功能[11]。本次實驗結(jié)果顯示束縛應(yīng)激致海馬CA3區(qū)神經(jīng)元的損傷，也可能與血清皮質(zhì)酮濃度升高有關(guān)。其機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

應(yīng)激機(jī)制研究較多，但抗應(yīng)激藥物的研究不多，目前中藥抗應(yīng)激作用研究正在引起重視。有研究表明中藥對慢性應(yīng)激大鼠海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用[12,13]，但尚未見加味保元湯對慢性應(yīng)激大鼠海馬神經(jīng)元損傷影響的研究報道。

保元湯由人參、黃芪、甘草、肉桂等四味藥組成，具有補(bǔ)氣溫陽之功效。《張氏醫(yī)通》將此方列為補(bǔ)氣類諸方之首，認(rèn)為補(bǔ)中益氣湯、升陽益胃湯、十全大補(bǔ)湯、人參養(yǎng)營湯均由該方變化而成，可見，保元湯實屬一補(bǔ)氣之祖方。因五味子具有寧心安神之功效[14]，所以，我們在保元湯中加入五味子，作為本研究的加味保元湯使用。前期研究表明，加味保元湯具有一定的抗應(yīng)激作用[4-6]。本次實驗結(jié)果顯示，加味保元湯中劑量組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)、結(jié)構(gòu)接近正常對照組，與模型組比較損傷較小，說明加味保元湯對慢性束縛應(yīng)激大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元損傷有一定的保護(hù)作用，關(guān)于加味保元湯抗應(yīng)激作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

[1]Watanabe Y, Gould E, McEwen B S, et al. Stress-induced atrophy of apical dendrites of hippocampal CA3 pyramidal neurons [J].Brain Res, 1992, 588(2): 341-345.

[2]Magarinos A M, McEwen B S. Stress-induced atrophy of apical dendrites of hippocampal CA3 neurons: comparison of stessors [J]. Neuroscience, 1995, 69(1): 83-88.

[3]孫莉, 陳英杰, 劉超, 等. 益智仁對束縛應(yīng)激大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元損傷的影響[J]. 大連大學(xué)學(xué)報, 2009, 30(6):87-90.

[4]Sapolsky RM. Why stress is bad for your brain [J]. Science,1996, 273: 749-750.

[5]孫莉, 韓耀輝. 加味保元湯對束縛應(yīng)激小鼠脾臟重量的影響[J]. 中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué), 2003, 12(2): 4-5.

[6]孫莉, 韓耀輝. 不同劑量加味保元湯對束縛應(yīng)激小鼠非特異性免疫功能的影響[J]. 中國心理衛(wèi)生雜志, 2003, 17(6):401-402.

[7]孫莉, 津田彰, 韓耀輝, 等. 拘束ストレスによるマウスの Tリンパ球転換率低下に及ばす加味保元湯の効果[J].久留米大學(xué)心理學(xué)研究, 2006(5): 133-138.

[8]Magarinos A M, Mc Ewen B S, Flugge G, et al. Chronic psychosocial stress causes apical dendritic atrophy of hippocampal CA3 pyramidal neurons in subordinate tree shrews [J]. Neuroscience, 1996, 16(10): 3534-3540.

[9]McEwen B S. Stress and hippocampal plasticity [J]. Annu Rev Neurosci, 1999, 22: 105-122.

[10]Duman R S, Malberg J, Thome J. Neural plasticity to stress and antidepressant treatment [J]. Biol Psychiatry, 1999, 46(9):1181-1191.

[11]Magarios AM, Verdugo JM, Bruce SM. Chronic stress alters synaptic terminal structure in hippocampus [J]. Proc Narl Acad Sci USA, 1997, 94: 14002-14008.

[12]黃泉智, 孫志高, 許成勇, 等. 舒郁寧心湯對抑郁模型大鼠行為及海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國中醫(yī)急癥, 2011,20(8): 1250-1251.

[13]陸潔, 歷璐帆, 翟融, 等. 柴胡加龍骨牡蠣湯有效部位對慢性應(yīng)激大鼠行為及海馬神經(jīng)組織的影響[J]. 藥學(xué)與臨床研究, 2011, 19(3): 231-234.

[14]李莉. 五味子酚等三種抗氧化劑對氧化應(yīng)激損傷中樞神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)理研究[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展, 1998,29(1): 35-38.