丁 寧，盧 芯，鄭叢龍，韋淳巍，許夢(mèng)亭，向 敏，林雨馨

（大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

0 引言

流感病毒（influenza virus）是單負(fù)鏈RNA病毒，屬于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的一種。通常分為人類和動(dòng)物流感病毒兩大類。其中人類流感病毒據(jù)其病毒核蛋白的抗原性可分為三類：A（甲），B（乙），C（丙）。由于流感病毒是以呼吸道傳播為主，預(yù)防困難，曾多次造成了全球范圍的大流行[1,2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)平均每一年因感染流感病毒直接造成15000人死亡，另一方面因流感間接致死的也高達(dá)500000人。迄今為止全球范圍內(nèi)還沒有特異的流感防治藥物。雖然目前普遍認(rèn)為可緩解病人的發(fā)病率及死亡率的措施是接種流感疫苗，但由于流感病毒變異迅速的特性，針對(duì)其有效的疫苗研制將需要幾個(gè)月，所以易感人群不能及時(shí)得到接種。另一方面現(xiàn)在臨床常用于治療流感的藥物主要是奧司他韋（達(dá)菲）、金剛烷胺、扎那米韋等，但目前使用均發(fā)現(xiàn)這些藥物存在不同程度的耐藥現(xiàn)象[2]。所以近年來基礎(chǔ)及臨床研究者都在積極尋找針對(duì)流感防治的有效藥物和方法，是微生物研究領(lǐng)域重中之重。

乙酰水楊酸（Acetylsalicylic Acid）俗名阿司匹林（AS），又稱醋柳酸,是分子量 180.16白色針狀或板狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末。無臭，微帶酸味。在干燥空氣中穩(wěn)定，遇潮則緩慢水解成水楊酸和醋酸。為臨床常用解熱鎮(zhèn)痛藥，藥理作用主要為：消炎、解熱、止痛及抗風(fēng)濕作用，其本身還有對(duì)血小板凝集的抑制作用[3]。本文主要討論阿司匹林在體外對(duì)流感病毒H1N1的抑制作用及其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和病毒株

細(xì)胞株：人肺癌細(xì)胞（A549），由大連市疾控中心惠贈(zèng)，傳代培養(yǎng)液氮保存。

病毒株：H1N1流感病毒，血凝效價(jià)(1:512)。中科院武漢市病毒所惠贈(zèng)，雞胚接種傳代液氮保存。

1.1.2 主要試劑

乙酰水楊酸（AS）：Sigma產(chǎn)品；RPMI1640：含有10%的胎牛血清；RPMI1640維持液：含2%的小牛血清；神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)試劑盒：江蘇碧云天。

1.1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱：美國NUAIR，型號(hào)NU-5500E；超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，型號(hào)BCN-1360B；倒置顯微鏡：日本 OLYMPUS，型號(hào)CKX44。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅細(xì)胞凝集（HA)試驗(yàn)檢測(cè)AS對(duì)H1N1的血凝效價(jià)影響

將等體積的0.5 mg/mL、2 mg/mL、10 mg/mL AS溶液與H1N1病毒液分別作用90 min，檢測(cè)各組病毒血凝效價(jià)。用于檢測(cè)AS對(duì)H1N1引起的紅細(xì)胞凝集是否有抑制作用。

1.2.2 AS對(duì)H1N1神經(jīng)氨酸酶活性抑制作用

按照神經(jīng)氨酸酶試劑盒操作要求，于室溫條件下1 mg/mL及5 mg/mL的AS分別作用于H1N1病毒60min（同時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照組），加熒光酶作用底物混勻后，37℃孵育20 min。設(shè)立發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)為460 nm和355nm，測(cè)定熒光值后計(jì)算病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶活性的抑制率。

1.2.3 雞胚接種法測(cè)定AS對(duì)H1N1病毒的抑制作用

1.5 mL EP管中分別將流感病毒液(效價(jià)為1:512)與等體積蒸餾水、AS溶劑及AS溶液（10 mg/mL）充分混合室溫作用2 h。分別取100 μL上述三種病毒混合液注射至雞胚尿囊腔中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。37℃溫箱孵育72 h后取出雞胚，置于4℃冰箱過夜，次日采集雞胚尿囊液，測(cè)定各個(gè)濃度AS對(duì)流感病毒的殺傷作用。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)測(cè)AS對(duì)H1N1血凝效價(jià)的影響

如圖1所示，病毒與0.5 mg/mL、2 mg/mL、10 mg/mLAS分別相互作用后的血凝效價(jià)分別為1:512、1:256、1:64和低于 1：2。結(jié)果表明，AS對(duì) H1N1表面的血凝素活性具有抑制作用，且作用比較顯著。

圖1 HA凝集抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AS對(duì)H1N1的血凝效價(jià)的影響

2.2 AS對(duì)病毒H1N1神經(jīng)氨酸酶活性的抑制作用

如圖2所示，AS作用濃度為1 mg/mL時(shí)作用60 min后對(duì) H1N1病毒神經(jīng)氨酸酶活性的抑制率大于40%，5 mg/mL的AS作用60 min后神經(jīng)氨酸酶活性的抑制率大于 80%，而病毒組的抑制率小于 20%，AS組與病毒對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明，AS阻斷病毒對(duì)細(xì)胞的感染的機(jī)制是通過抑制H1N1包膜上的神經(jīng)氨酸酶活性來實(shí)現(xiàn)的。

圖2 AS對(duì)H1N1病毒神經(jīng)氨酸酶活性的抑制作用

2.3 雞胚接種試驗(yàn)檢測(cè)AS對(duì)流感病毒的滅活作用

如圖3所示，AS作用流感病毒H1N1后感染雞胚，收集尿囊液，血凝試驗(yàn)檢測(cè)其病毒液效價(jià)均小于1:2，檢測(cè)溶劑對(duì)照組和病毒組效價(jià)均為1:512。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AS在體外濃度為10 mg/mL能有效抑制病毒增值。

圖3 雞胚培養(yǎng)法檢測(cè)AS對(duì)流感病毒H1N1的滅活作用

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，流感病毒在AS作用下，血凝素對(duì)紅細(xì)胞的凝集能力以及神經(jīng)氨酸酶的活性都有明顯的抑制作用。AS體外抗流感病毒作用的一個(gè)重要的機(jī)制可能是AS對(duì)流感病毒中這兩種蛋白質(zhì)的直接作用。目前研究認(rèn)為流感病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)流感病毒H1N1血凝素和神經(jīng)氨酸酶起到關(guān)鍵作用，對(duì)這兩種蛋白功能產(chǎn)生的抑制，將有效阻止其感染宿主細(xì)胞。另一方面雞胚接種實(shí)驗(yàn)則表明，乙酰水楊酸在濃度為10 mg/mL時(shí)對(duì)流感病毒H1N1有直接殺滅的作用。

對(duì)于加強(qiáng)臨床流感病毒感染預(yù)防工作而言，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AS對(duì)流感病毒具有直接殺滅作用具有重要意義[4]。AS在臨床各科室常用于消炎、解熱、止痛、抗風(fēng)濕及抗凝，局部使用無明顯毒副作用（過敏反應(yīng)除外）；尤其近年研究顯示其對(duì)于消化道腫瘤、艾滋病毒均有一定抑制作用，使得人們對(duì)其藥物作用機(jī)理的研究引發(fā)起新的熱潮。查閱文獻(xiàn)表明，其使用濃度均高于本研究中乙酰水楊酸對(duì)流感病毒作用的劑量[2,5]。因此，本課題組將應(yīng)用分子生物學(xué)等手段進(jìn)一步深入研究AS對(duì)病毒直接滅活的作用機(jī)制。

[1]Fedso DS. Vaccine development for an imminent pandemic:why we should worry, what we must do [J]. Hum Vaccine,2006, 2(1): 38-42.

[2]Alan WH. Vaccines for pandemic influenza: The history of our current vaccines, their limitations and the requirements to deal with a pandemic threat [J]. Ann Acad Med Singapore,2008, 37(6): 510-517.

[3]張曉冬. 阿司匹林的藥理特性及其臨床應(yīng)用[J]. 黑龍江科技信息, 2011(04): 30.

[4]林雨馨, 王兆雪, 楊喆東, 等. N-乙酰半胱氨酸體外對(duì)流感病毒H1N1的抑制作用[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2014(02):112-117.

[5]湯玲珍. 阿司匹林在H2O2誘導(dǎo)的人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用及機(jī)制研究[D]. 第四軍醫(yī)大學(xué), 2012.