組織塊法和酶消化法培養(yǎng)大鼠頜下腺細(xì)胞的比較研究

王 蕾，王雪紅，張華炎，汪義菲，熊 永，韓立赤

（大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

0 引言

位于頜下三角的頜下腺是三大唾液腺之一，屬混合性腺。其主要功能是產(chǎn)生和分泌涎液，為無(wú)刺激狀態(tài)下涎液分泌的主要來(lái)源[1]。頭頸部惡性腫瘤放療及其他非腫瘤性頜下腺疾病均涉及到腺體結(jié)構(gòu)和功能的損傷，導(dǎo)致口干、咀嚼吞咽困難和語(yǔ)言障礙等，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量。組織工程重建頜下腺是目前極具前景的治療手段，如何有效地獲得大量頜下腺細(xì)胞，進(jìn)而深入探討頜下腺的生理和病理機(jī)制，是需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較組織塊法和酶消化法原代培養(yǎng)大鼠乳鼠頜下腺細(xì)胞的優(yōu)劣，尋求一種最佳的頜下腺細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，為涎腺非腫瘤疾病的防治研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要儀器設(shè)備

新出生3～5天Wistar大鼠乳鼠（大連大學(xué)動(dòng)物中心），凈化工作臺(tái)（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國(guó)），倒置顯微鏡(Olympus，日本)，低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），胰酶（Hyclone，美國(guó)），DMEM高糖培養(yǎng)液（Hyclone，美國(guó)），PBS緩沖液，優(yōu)質(zhì)胎牛血清（Hyclone，美國(guó)），羊抗小鼠Cytokeratin-8單克隆抗體（Santa Cruz,美國(guó)）。

1.2 研究方法

1.2.1 組織塊法培養(yǎng)大鼠乳鼠頜下腺細(xì)胞

選擇健康大鼠乳鼠，在超凈臺(tái)內(nèi)取頜下腺，在PBS緩沖液中去除頜下腺包膜及血管，并漂洗3次；在培養(yǎng)皿中將頜下腺剪切成1 mm3小塊，剪切過(guò)程中適當(dāng)向組織塊滴加1～2滴DMEM高糖無(wú)血清培養(yǎng)液，以保持濕潤(rùn)；用眼科剪將剪切好的20～30塊組織送入血清包被的培養(yǎng)瓶中，組織塊間距約5 mm；放置后，緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，瓶底朝上，將培養(yǎng)瓶?jī)A斜放置于培養(yǎng)箱中；4 h后，培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)后平放，在凈化工作臺(tái)內(nèi)加入5 mL DMEM高糖培養(yǎng)液以覆蓋組織塊，于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.2 酶消化法培養(yǎng)大鼠乳鼠頜下腺細(xì)胞

選擇健康大鼠乳鼠，超凈臺(tái)內(nèi)取頜下腺，PBS洗3次；將組織塊移入2 mL EP管，剪切成糊狀，加入1 mL消化液（無(wú)血清培養(yǎng)液0.5 mL+0.25%胰酶0.5 mL）；放入培養(yǎng)箱中，消化40 min，每10 min振蕩一次；消化結(jié)束，重懸細(xì)胞，移入10 mL離心管，向離心管中加入3 mLDMEM高糖培養(yǎng)液，800 rpm，5 min離心；棄上清，加入3 mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶，DMEM高糖培養(yǎng)液補(bǔ)足至5 mL；將培養(yǎng)瓶放于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

細(xì)胞覆蓋瓶底80%以上時(shí)，即可進(jìn)行細(xì)胞傳代。①棄去舊培養(yǎng)液，加入0.25%的胰酶1 mL消化2 min，再用3 mLDMEM高糖培養(yǎng)液終止消化；②用毛滴管吹打重懸細(xì)胞，將其移入到10 mL的離心管中，1000 rpm，5 min離心；③棄上清，加入3 mL的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，徹底吹打離心管壁和底部，充分重懸；④將重懸液平均移入3個(gè)培養(yǎng)瓶中，分別補(bǔ)足DMEM高糖培養(yǎng)液至5 mL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況

利用倒置顯微鏡連續(xù)觀察原代和傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并拍照記錄。

1.4 細(xì)胞來(lái)源鑒定

取第二代細(xì)胞，爬片，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS沖洗后用0.2%Triton X-100透化15 min，PBS沖洗，0.3%H2O2室溫孵育30 min阻斷內(nèi)源過(guò)氧化物酶，再用PBS沖洗，20%的馬血清室溫封閉20 min后加入細(xì)胞角蛋白-8，置濕盒中4°C過(guò)夜。經(jīng)PBS沖洗后加入生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，PBS沖洗后加入辣根酶標(biāo)記的三抗室溫孵育 30 min，PBS沖洗后用DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)強(qiáng)度，PBS沖洗后甘油封片。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

組織塊法原代培養(yǎng)2天后，少量細(xì)胞從組織塊中游離出來(lái)，不均勻分布；3天后，組織塊周?chē)坞x出較多細(xì)胞，以組織塊為中心呈放射狀排列分布，初步形成了腺泡、腺管樣結(jié)構(gòu)，但覆蓋范圍較小，不能進(jìn)行傳代。酶消化法原代培養(yǎng)2天后，約3/4的培養(yǎng)瓶底部覆蓋了大量分布不均的細(xì)胞；4天后，細(xì)胞完全覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底，并出現(xiàn)復(fù)層生長(zhǎng)，形成了腺泡、腺管樣結(jié)構(gòu)，可傳代培養(yǎng)。

傳代后，兩種方法獲得的細(xì)胞均出現(xiàn)了3種形態(tài)。第一種為圓亮、界限清晰且無(wú)胞質(zhì)突起的圓形亮細(xì)胞；第二種為扁平、數(shù)量及胞質(zhì)突起均較多的多角形暗細(xì)胞，相互聚集形成腺泡、腺管樣結(jié)構(gòu)；第三種為數(shù)量少、界限清晰的梭形暗細(xì)胞。傳代2天后，組織塊法培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量較少，貼壁較差；酶消化法培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁情況好，數(shù)量較多，生長(zhǎng)情況較好。

圖1 組織塊法和酶消化法原代培養(yǎng)頜下腺細(xì)胞

圖2 組織塊法和酶消化法傳代培養(yǎng)頜下腺細(xì)胞

2.2 RSGC的鑒定結(jié)果

鏡下見(jiàn)細(xì)胞角蛋白-8免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽(yáng)性。細(xì)胞呈立方形、三角形或多邊形。細(xì)胞伸展良好，胞核藍(lán)染偏向一側(cè)，核仁1～2個(gè)，胞質(zhì)呈棕黃色，核膜及包膜清晰，部分細(xì)胞中可見(jiàn)深染細(xì)小顆粒狀物質(zhì)。細(xì)胞團(tuán)塊中部黃染較強(qiáng)，周邊減弱，提示為上皮細(xì)胞來(lái)源。陰性對(duì)照組中細(xì)胞形態(tài)同上述，胞質(zhì)呈淡藍(lán)色，胞核藍(lán)染偏向一側(cè)，核仁1～2個(gè)，部分細(xì)胞中亦可見(jiàn)深染細(xì)小顆粒狀物質(zhì)。

圖3 DAB染色

3 討論

舍格倫綜合征、放射性涎腺炎、藥物過(guò)敏及其他自身免疫疾病等原因造成的涎腺分泌功能?chē)?yán)重?fù)p害十分常見(jiàn)，給人們的健康帶來(lái)很大影響。20世紀(jì)80年代后期提出“組織工程”概念后，其原理和方法已廣泛應(yīng)用于骨、軟骨、皮膚和肌腱等組織及器官的再造，并取得了令人矚目的成就。隨著頜下腺組織工程的發(fā)展，在再造涎腺的研究中, 對(duì)于細(xì)胞的來(lái)源及增殖能力提出要求[2,3]，如何成功培養(yǎng)頜下腺細(xì)胞變得至關(guān)重要。

大鼠頜下腺在出生時(shí)并未發(fā)育完全，頜下腺細(xì)胞在出生后繼續(xù)分化增殖[4]。Oliver等[5]成功分離、培養(yǎng)了涎腺細(xì)胞，在體外培養(yǎng)存活達(dá) 4周以上。Burford-Mason等[6]取新生乳鼠頜下腺組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，新生乳鼠細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞可保持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性。國(guó)內(nèi)學(xué)者劉超等[7]取1天的乳鼠，羅小寧[8]等用8天的乳鼠培養(yǎng)頜下腺細(xì)胞，均成功培養(yǎng)傳代。我們的實(shí)驗(yàn)中選擇3～5天的乳鼠作為細(xì)胞取材對(duì)象。相較1天乳鼠的頜下腺過(guò)小而言，3～5天取材和去除筋膜更容易；又較8天乳鼠的細(xì)胞活性更強(qiáng)。

頜下腺細(xì)胞培養(yǎng)方法有組織塊法和酶消化法，組織塊法是將組織剪碎培養(yǎng)，酶消化法是利用胰蛋白酶消化細(xì)胞間質(zhì)，使頜下腺細(xì)胞分離出來(lái)。組織塊法操作簡(jiǎn)單，但是細(xì)胞要從組織塊中游離生長(zhǎng)，原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。胰酶消化法可獲得大量的細(xì)胞，但過(guò)度消化細(xì)胞會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)較大的傷害[9]。在實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)組織塊法培養(yǎng)的細(xì)胞在剪切過(guò)程中盡量剪切更細(xì)小，并向組織塊滴加1～2滴DMEM高糖無(wú)血清培養(yǎng)液，以保持濕潤(rùn)以利于維持組織的活性。在鋪瓶時(shí)用眼科剪將剪切好的 20～30塊組織送入血清包被的培養(yǎng)瓶中，組織塊間距約5 mm，保證更多的生長(zhǎng)中心，且均勻分布。在酶消化法中，保證頜下腺剪切成糊狀，并直接放于 CO2孵箱孵育，使其保持在37℃的環(huán)境中；孵育40 min，每間隔10 min震蕩一次，振蕩頻率降低，使消化更充分。離心后未完全棄掉上清，留約1 mL上清液，避免過(guò)多細(xì)胞丟失。

本實(shí)驗(yàn)采用組織塊法和酶消化法兩種方法原代培養(yǎng)大鼠乳鼠頜下腺細(xì)胞。組織塊法操作簡(jiǎn)單，用時(shí)短，成功率高，但經(jīng)該法培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，原代細(xì)胞貼壁能力差，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，且分布不均，經(jīng)過(guò)1：3傳代后，所獲細(xì)胞少，需經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間才能覆蓋培養(yǎng)瓶底，難以在短期內(nèi)獲得大量頜下腺細(xì)胞。酶消化法雖操作較復(fù)雜，但貼壁情況較好，細(xì)胞數(shù)量多，分布均勻，且增殖較快。原代培養(yǎng)3天后即可傳代培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)1：3傳代后，細(xì)胞數(shù)量依然較多，貼壁情況好，2天后細(xì)胞可覆蓋培養(yǎng)瓶底，短期內(nèi)可獲得大量頜下腺細(xì)胞。

頜下腺細(xì)胞的鑒定主要通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法。上皮細(xì)胞用于鑒定的抗原一般為細(xì)胞角蛋白和波形絲蛋白，腺上皮細(xì)胞對(duì)細(xì)胞角蛋白表現(xiàn)出免疫反應(yīng)性，而肌上皮細(xì)胞則對(duì)波形絲蛋白表現(xiàn)免疫反應(yīng)性。本實(shí)驗(yàn)兩種方法培養(yǎng)出的頜下腺細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)細(xì)胞角蛋白-8染色均呈陽(yáng)性表達(dá)，提示為上皮細(xì)胞來(lái)源。

頜下腺細(xì)胞體外培養(yǎng)具有重要的生物學(xué)及臨床意義。確定一種合理且高效的體外細(xì)胞分離與培養(yǎng)方法，對(duì)于涎腺疾病的研究及諸多與其相關(guān)的離體實(shí)驗(yàn)，如基因轉(zhuǎn)染、藥物作用等各方面的研究有著非常重要的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，酶消化法和組織塊法均可獲得3種類(lèi)型的細(xì)胞，傳代后在細(xì)胞特征上也無(wú)特殊差異，但酶消化法短期內(nèi)可獲得大量頜下腺細(xì)胞。因此，酶消化法是一種較實(shí)用的培養(yǎng)大鼠乳鼠頜下腺細(xì)胞的方法。

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