冷瀟，楊淑霞，李衛(wèi)天，葛芳蘭，李維，王衍堂＊

（1.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，成都 610083；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610066）

甾體化合物雄甾-4-烯-3，17-雙酮（andros-t 4-ene-3，17-dione，4AD）是制造甾體激素類藥物的關(guān)鍵藥物中間體之一，主要用來生產(chǎn)雄性激素、蛋白同化激素、螺內(nèi)酯等藥物［1］。一方面它可以利用具有C-1，2脫氫酶的微生物如一些節(jié)桿菌（Arthrobacter）、分枝桿菌（Mycobacterium）等［2］通過一步脫氫反應(yīng)轉(zhuǎn)化成另一種重要的甾體藥物中間體雄 甾-1，4-二 烯-3，17-二 酮 （ANDROSTA-1，4-DIENE-3，17-DIONE，ADD），ADD 是開發(fā)雌性激素以及避孕藥的前體，它是合成19-去甲甾體系列雌激素，如雌酮（Estrone）、炔諾酮（Norethisterone）和黃體酮（Progestin）的重要前體物［3］。另一方面甾體藥物4AD的每一個(gè)羥基化位點(diǎn)都有活性和價(jià)值［4］，其產(chǎn)物可應(yīng)用于臨床作為利尿劑、避孕藥、抗炎癥和心血管藥物。據(jù)文獻(xiàn)［5］報(bào)道，4AD能被新月彎孢霉、木霉、紅色微球菌屬、青霉菌屬等轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物有C6β-、C9α-、C14α-、C11-、C14α、C15α－羥化衍生物和17β－雙羥化衍生物。而利用生物催化法生產(chǎn)17－OH-4AD的研究未見公開報(bào)道，大部分研究工作都集中在利用微生物制備11α-OH-4AD［6］。

本研究從四川師范大學(xué)生物技術(shù)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室保存的具有甾體轉(zhuǎn)化能力的菌株中篩選對4AD進(jìn)行有效轉(zhuǎn)化的真菌，獲得了一株轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)的菌株，經(jīng)鑒定為茄病鐮孢菌（Fusariumsolani），文獻(xiàn)中茄病鐮孢菌對4AD的轉(zhuǎn)化未見報(bào)道，通過對4AD的轉(zhuǎn)化，以期得到具有潛在生物活性的衍生物，為相關(guān)新藥的研究與設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 實(shí)驗(yàn)所用菌株為四川師范大學(xué)生物技術(shù)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室分離并保存的真菌菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L，pH 自然，121℃滅菌15min。種子和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L、黃豆粉5g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉5g/L、磷酸氫二鉀5g/L，pH 5.5，115℃滅菌20min。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 4AD購自美國Sigma公司；薄層色譜硅膠 GF-254，柱色譜硅膠 G（200-300目，試劑級）購自青島海洋化工有限公司；石油醚、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、正己烷、環(huán)己烷、無水乙醇、異丙醇等所有試劑均為分析純，購自成都科龍化工試劑廠。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 DOC-2000凝膠成像分析系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）、HBSP05PCR擴(kuò)增儀（美國 ThermoHybaid公司）、ZF-3紫外透射儀（上海長新機(jī)械廠）、恒溫培養(yǎng)箱（上海恒科技有限公司）、HZQ-C空氣浴振蕩器（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠）、RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、Nicolet 6700FT-i.r型紅外光譜儀（美國Thermo公司）、Bruker Avance-600型核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）、Q-TOF micro型質(zhì)譜儀（美國waters公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化菌株的篩選 從四川師范大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室挑選出70株有甾體轉(zhuǎn)化能力的菌株，于PDA平板中活化，28～30℃培養(yǎng)5～6d，待其長出豐滿的孢子。將孢子用20mL無菌水洗后移入裝有適量玻璃珠的三角瓶中，200r/min振蕩20 min，紗布過濾除去菌絲，制成1.2×108個(gè)/mL的孢子懸液。用10mL無水乙醇溶解0.5g AD，超聲震蕩20min，待其完全溶解于無水乙醇，滅菌保存，制成底物溶液。將制備的孢子液按一定的接種量接種到裝有50mL發(fā)酵液的500mL三角瓶中，30℃，200r/min培養(yǎng)24h，當(dāng)搖瓶中長出大量菌絲體后，按照0.5%的投料量加入AD底物溶液，30℃、200 r/min轉(zhuǎn)化108h。AD轉(zhuǎn)化24h后，每隔12h取1 mL發(fā)酵液，4 000rpm離心20min，取發(fā)酵液上清，加入等體積萃取液進(jìn)行萃取，萃取3次，合并萃取相，TLC分析萃取相，環(huán)己烷∶乙酸乙酯＝7∶3（v/v）作展開劑，硫酸∶甲醇＝1∶10（v/v）為顯色劑，樣品用上行展開法展開，電吹風(fēng)吹干后，用紫外投射儀觀察，顯色劑噴霧，105℃加熱3min，顯色觀察。將薄層色譜硅膠GF254與5‰CMC-Na溶液按1∶3比例混合研磨均勻，用制板機(jī)鋪于潔凈的玻璃板上，自然干燥1d后于110℃活化0.5h，置于干燥器內(nèi)備用。

1.2.2 菌種分子鑒定 CTAB法［7］提取的真菌DNA為模板，真菌通用引物［8］擴(kuò)增該菌的ITS序列。 上 游 引 物：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′ 下 游 引 物：ITS4：5′-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′ PCR反應(yīng)體系為50μL體系：基因組DNA 1μL，上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP 4.5μL，Taq酶0.5μL，ddH2O 33μL，MgCl23μL。PCR反應(yīng)條件：1）94 ℃預(yù)變性2min；2）94℃變性1 min；60℃退火1min；72℃延伸1min；35個(gè)循環(huán)；3）72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。點(diǎn)入DNA marker DL2000（DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)）進(jìn)行分子量標(biāo)記，檢測擴(kuò)增片段分子量。擴(kuò)增序列委托上海生工進(jìn)行測序，其結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行基因比對。

1.2.3 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化及結(jié)構(gòu)分析 AD作底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，當(dāng)轉(zhuǎn)化進(jìn)行到96h時(shí)，將發(fā)酵液取出，4 000prm離心20min，取上清液，等體積的乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋蒸至漿狀物。旋蒸后的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用等體積乙酸乙酯萃取上樣，環(huán)己烷∶乙酸乙酯系統(tǒng)（7∶3、7∶1、7∶6）作洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，流速為1 mL/min，部分收集器收集，洗脫過程中通過TLC和硫酸顯色跟蹤檢測，合并相同部分，得到AD－A和AD-B兩個(gè)部分。AD-A部分經(jīng)過重結(jié)晶進(jìn)一步純化得到化合物AD-1；AD-B部分用環(huán)己烷∶乙酸乙酯系統(tǒng)（1.5∶1、1∶1、2∶1）梯度洗脫，經(jīng)過重結(jié)晶得到化合物AD-2。

1.2.4 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定 將分離純化得到的2種化合物進(jìn)行 TOF-MS、IR、1HNMR、13C NMR光譜數(shù)據(jù)分析，同時(shí)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相結(jié)合，進(jìn)行物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié)果

2.1 具有轉(zhuǎn)化AD菌株的篩選

本實(shí)驗(yàn)從四川師范大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室挑選出的70株菌株均為霉菌，能夠以膽固醇作唯一碳源進(jìn)行生長，對甾體物質(zhì)有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化能力，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，甾體羥基化反應(yīng)多發(fā)生在霉菌中，所以在70株菌中很可能會(huì)有能夠?qū)D進(jìn)行羥基化的菌株。筆者通過利用AD作底物，TLC和硫酸顯色跟蹤檢測，出現(xiàn)了除底物對應(yīng)的Rf值以外的斑點(diǎn)，則視作該菌株對AD有轉(zhuǎn)化能力，篩選到有5株菌對AD有轉(zhuǎn)化能力（見表1）。

其中7-1這株菌轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，底物轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化96h底物幾乎完全降解，產(chǎn)物組分雜質(zhì)少，檢測到有2個(gè)產(chǎn)物，其中有1個(gè)主產(chǎn)物，產(chǎn)量較高，便于今后對目標(biāo)產(chǎn)物的分離提純，所以選擇7-1菌株進(jìn)行研究。

表1 對AD有轉(zhuǎn)化能力的菌株

2.2 菌種初步鑒定

ITS序列是真核生物染色體上編碼核糖體小亞基RNA的基因，從其排列順序即可鑒定菌種種系發(fā)育上的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過用CTAB法提取真菌基因組，PCR法擴(kuò)增ITS序列，進(jìn)行測序分析，該基因序列長度為539bp。提交到Genbank，序列號為GUO79682。通過NCBI的BLAST同源序列分析，發(fā)現(xiàn)該菌株的ITS序列與鐮孢菌屬同源性較高，相似度為95.6%～99.9%，茄病鐮孢菌（Fusarium solani）與該菌相似性達(dá)到了99.9%，可以初步判定該菌為茄病鐮孢菌。

2.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離及鑒定

在發(fā)酵過程中，TLC定期檢測，初步了解到茄病鐮孢菌對AD的轉(zhuǎn)化過程（見圖1）。轉(zhuǎn)化96h，底物徹底降解，在轉(zhuǎn)化48h時(shí)，通過TLC檢測到發(fā)酵液中AD-1出現(xiàn)，72h達(dá)到最大量，估算轉(zhuǎn)化率為83%，AD-2在84h的發(fā)酵液中被發(fā)現(xiàn)，96h時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到37%。

圖1 生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)推導(dǎo)

AD-1：Androst-1，4-dien-3，17-dione

mp138-142℃（文獻(xiàn)中為139～141 ℃［3］）；IR vmax（cm－1）1740，1656，1621 1601；TOF-MS m/z 285［M＋H］＋，307［M＋Na］＋，323［M＋K］＋，591［2M＋Na］＋；1H NMR （CDCl3）δ （ppm）7.04（1H，d，J＝10Hz，H-1），6.24（1H，dd，J＝10.2，1.9Hz，H-2），6.09 （1H，s，H-4），0.95 （3H，s，H-18），1.25（3H，s，H-19）；Rf（環(huán)己烷∶乙酸乙酯＝7∶3）＝0.25.

AD-2：17-hydroxy－pregen-1，4-dien-3-one：

IR vmax：3476，1660，1618，1598cm－1；TOF-MS m/z 259［M＋H］＋，281 ［M＋Na］＋，297 ［M＋K］＋，1H NMR （CDCl3）δ（ppm）7.05 （1H，d，J＝10.1，H-1），6.23（1H，dd，J＝2.0，10.1，H-2），6.07（1H，s，H-4），3.64 （1H，t，J＝ 8.6，H-17），0.83（3H，s，H-18），1.24 （3H，s，H-19）.Rf（環(huán)己烷∶乙酸乙酯＝1∶1）＝0.33。

代謝產(chǎn)物AD-1的TOF-MS譜顯示它的［M＋H］＋處于m/z 285，在AD的結(jié)構(gòu)里加入了2個(gè)氫原子，紅外光譜在1740cm－1、1656cm－1、1621cm－1、1601cm－1峰處的特征吸收分別對應(yīng)C-17位酮基、C-3位酮基、C-1和 C-2之間雙鍵、C-4和 C-5之間雙鍵，對比AD的13C NMR譜，C1和C2的吸收峰值從δ35.2和32.6ppm位置化學(xué)位移到δ155.1和127.8ppm，分別增加了119.9ppm和95.2ppm。氫譜顯示2個(gè)雙峰在δ7.04和6.24ppm出現(xiàn)，C1和C2之間出現(xiàn)了雙鍵。該產(chǎn)物的光譜數(shù)據(jù)和ADD［3］完全一致，可以確定該產(chǎn)物是ADD。

代謝產(chǎn)物AD-2的紅外光譜特征吸收顯示，吸收峰的值從1740cm－1變成了3476cm－1，表示 C-17位的羰基由一個(gè)羥基取代。C譜顯示一個(gè)新的含氧次甲基在δ81.5ppm峰出現(xiàn)，H譜一個(gè)在δ3.64（1H，t，J＝8.6，H-17）峰新的信號也證明了 C-17位羥基出現(xiàn)，證明了該物質(zhì)是17-hydroxy－pregen-1，4-dien-3-one（見表2）。

表2 化合物核磁共振碳譜譜值

3 討論

不同于從土壤中富集培養(yǎng)對甾體轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行篩選或者從已報(bào)道有轉(zhuǎn)化能力的菌屬中進(jìn)行檢測，本研究從四川師范大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室挑選出70株具有甾體轉(zhuǎn)化能力和羥基化潛力的霉菌進(jìn)行篩選，通過利用這種有針對性的篩選方法快速篩選到幾株能夠有效轉(zhuǎn)化AD生成新的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的菌株，并選擇7-1這株菌開展進(jìn)一步研究。

在對菌株7-1的發(fā)酵過程中，定期檢測AD的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，根據(jù)薄層層析檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物的生成順序?yàn)锳D→AD-1→AD-2，經(jīng)過結(jié)構(gòu)鑒定和薄層層析檢測，筆者確定AD-1是ADD。ADD和AD相比較，在物質(zhì)結(jié)構(gòu)上，在C1和C2位之間多了一個(gè)雙鍵，這屬于典型的C1，2位脫氫反應(yīng)，需要脫氫酶才可以進(jìn)行，這種脫氫反應(yīng)存在于很多微生物的生物轉(zhuǎn)化過程中。膽固醇的微生物代謝過程經(jīng)過Griffin等［9］的研究已較清楚，AD轉(zhuǎn)化成ADD是代謝過程的一步重要反應(yīng)。為了弄清AD-2的生成過程，筆者以ADD作底物來進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)該菌可以直接將ADD轉(zhuǎn)化成AD-2，從另一側(cè)面證明了AD-1轉(zhuǎn)化生成 AD-2這一生物轉(zhuǎn)化過程。通過AD-2和ADD對比，在物質(zhì)結(jié)構(gòu)上，發(fā)現(xiàn)C17位的酮基被一個(gè)羥基所替代，這一反應(yīng)屬于還原反應(yīng)。在微生物對甾體轉(zhuǎn)化的反應(yīng)類型里，酮基還原成羥基主要是在 C-3，C-17，C-20位發(fā)生［10］。

綜上對7-1這株菌進(jìn)行ITS序列分析，確定其為茄病鐮孢菌，經(jīng)過對此株菌的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，得到了具有較 大 生 物 活 性 潛 力 的 17-hydroxy－pregen-1，4-dien-3-one和重要的藥物中間體ADD，能夠利用茄病鐮孢菌轉(zhuǎn)化AD生成這兩種產(chǎn)物在國內(nèi)外研究中還未見相關(guān)報(bào)道［1］，該菌對于利用微生物轉(zhuǎn)化的方法生產(chǎn)17位羥基化AD和ADD具有較大的應(yīng)用潛力。有關(guān)茄病鐮孢菌對AD轉(zhuǎn)化反應(yīng)中的底物溶解性提高和發(fā)酵條件優(yōu)化的問題還在進(jìn)一步研究中。

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