襲辰辰　馮艷春　胡昌勤

摘要在玻碳電極表面修飾碳納米管，并用多電位階躍法在碳納米管表面沉積納米金制得碳納米管/納米金復(fù)合膜。通過納米金和微囊藻毒素（亮氨酸精氨酸）抗體之間的吸附作用，將抗微囊藻單克隆抗體固定于電極表面，以牛血清白蛋白封閉非特異性吸附位點(diǎn)，研制了檢測(cè)微囊藻毒素的電化學(xué)免疫傳感器。利用微囊藻毒素與其抗體之間的特異性識(shí)別作用構(gòu)建“三明治”夾心結(jié)構(gòu)的免疫分析模式，以辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體為二抗，利用微分脈沖伏安法實(shí)現(xiàn)了對(duì)微囊藻毒素的檢測(cè)。在優(yōu)化條件下，此傳感器的響應(yīng)電流與微囊藻毒素濃度在0.50～12.0 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.30 μg/L（S/N=3）。對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行了微囊藻毒素的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率在93.0%～108.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%～5.0%。

關(guān)鍵詞微囊藻毒素； 碳納米管/納米金復(fù)合膜； 電化學(xué)免疫傳感器

1引言

微囊藻毒素（Microcystins，MCs）是由淡水藍(lán)綠藻產(chǎn)生的一類毒性強(qiáng)、急性危害大的環(huán)七肽縮氨酸肝毒素，對(duì)水生生物、人類飲用水安全和人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響＼[1，2＼]。其中， 微囊藻毒素（亮氨酸精氨酸）（Microcystin（leucinearginine），MCLR）是最常見、急性毒性最大的微囊藻毒素之一＼[3，4＼]，水體中MCLR的含量已被多個(gè)國(guó)家和組織作為衡量水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)重要指標(biāo)＼[5＼]。目前， 檢測(cè)水體中MCLR的傳統(tǒng)方法中，高效液相色譜法、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)效果較好，但其儀器設(shè)備價(jià)值昂貴、操作繁瑣且對(duì)操作人員技術(shù)要求較高；植物細(xì)胞的生物測(cè)試法和蛋白磷酸酶抑制法靈敏度相對(duì)較低；酶聯(lián)免疫吸附法靈敏度較高，但其線性范圍較窄＼[6～10＼]。在傳統(tǒng)檢測(cè)方法得到廣泛應(yīng)用的同時(shí)，研究者不斷將新技術(shù)引入到MCLR測(cè)定中，以期待建立更快速、更靈敏的MCLR檢測(cè)方法。

電化學(xué)免疫傳感器將免疫反應(yīng)的特異性和電化學(xué)的便捷性相結(jié)合，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速方便、可微型化和容易實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)＼[11，12＼]，在測(cè)定MCLR的研究中展現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景＼[13＼]。在發(fā)展電化學(xué)免疫傳感器的過程中，抗體的有效固定及其活性保持和電化學(xué)信號(hào)的放大是關(guān)鍵的問題＼[14＼]。納米材料由于其特殊的電化學(xué)性質(zhì)而備受關(guān)注＼[15＼]。其中，納米復(fù)合膜在增大材料的比表面積、提高表面反應(yīng)活性、改善催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)條件等方面突破了單一組分材料性能的局限，表現(xiàn)出良好的生物親和性、導(dǎo)電性、高催化活性等突出優(yōu)點(diǎn)＼[16＼]，使其更適合應(yīng)用于電化學(xué)分析領(lǐng)域。基于碳納米管（CNTs）和納米金（AuNPs）的優(yōu)良特性＼[17＼]，本研究制備了碳納米管/納米金復(fù)合膜，并將其用于構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)水體中MCLR，此傳感器表現(xiàn)出了較高的靈敏度和較好的選擇性，具有較寬的測(cè)量范圍。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

CHI 660C型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），電化學(xué)反應(yīng)池為三電極體系：以玻碳電極為基底的免疫傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極；S4800型掃描電子顯微鏡（SEM， Hitachi公司）。

辣根過氧化物酶（HRP）、牛血清白蛋白（BSA）、HAuCl4·3H2O（美國(guó)Sigma公司）；MCLR標(biāo)準(zhǔn)品、antiMCLR單抗和多抗（北京伊普瑞斯科技有限公司）；HRP標(biāo)記的antiMCLR多抗（antiMCLRHRP）依據(jù)參考文獻(xiàn)＼[11＼]制備；碳納米管（CNTs）購于深圳納米港，并按文獻(xiàn)＼[17＼]方法進(jìn)行純化，將純化好的碳納米管溶于N，N二甲基甲酰胺制得碳納米管溶液（0.10 mg/mL）；其它試劑均購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水（電阻率為18 MΩ·cm）。稀釋液：0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS， pH 7.4），置于4 ℃的冰箱中保存。洗滌液為稀釋液加入0.05% Tween20， 封閉液為含有2%牛血清白蛋白的PBS。

2.2免疫傳感器的制備

玻碳電極（GCE， Φ=3 mm）用Al2O3拋光至鏡面，依次用丙酮、1.0 mol/L HNO3、1.0 mol/L NaOH及二次蒸餾水超聲清洗5 min。將處理好的玻碳電極吹干后，滴涂10 μL 碳納米管溶液，并在紅外燈下烘干。將制得的GCE/CNT電極放入含有0.10 mmol/L HAuCl4的H2SO4溶液（0.50 mol/L）中，用多電位階躍的方法在電極表面沉積納米金（在1.055～

Symbolm@@ 0.045 V 的階躍電位范圍內(nèi)掃描15 s）制備GCE/CNT/AuNP電極。將電極用二次蒸餾水清洗并吹干后，滴涂10 μL antiMCLR單抗，并在37 ℃條件下孵育60 min， 然后用洗滌液清洗電極以除去未結(jié)合的抗體并晾干。在電極表面滴加10 μL 封閉液，孵育30 min以封閉活性位點(diǎn)。

2.3電化學(xué)檢測(cè)

將制備的免疫傳感器清洗并吹干后，放入一定濃度的MCLR溶液中，在37 ℃下培養(yǎng)60 min。用洗滌液清洗電極后，將10 μL antiMCLRHRP滴于電極表面并放置60 min。然后，用水清洗電極并將其放入5 mL含有0.80 mmol/L H2O2和0.50 mmol/L對(duì)苯二酚的PBS中，用微分脈沖伏安法進(jìn)行定量檢測(cè)，掃描范圍為

Symbolm@@ 0.6～0.4 V。以對(duì)苯二酚為電子媒介體，通過HRP催化H2O2產(chǎn)生的響應(yīng)電流實(shí)現(xiàn)對(duì)MCLR的檢測(cè)。電化學(xué)交流阻抗（EIS）測(cè)試條件：應(yīng)用電位0.20 V，振幅0.05 V，頻率為0.10 Hz～100 kHz， 靜置時(shí)間2 s；循環(huán)伏安（CV）測(cè)試條件：電壓范圍

3結(jié)果與討論

3.1免疫傳感器的掃描電子顯微鏡圖和電化學(xué)表征

用掃描電子顯微鏡表征修飾電極（GCE/CNT和GCE/CNT/AuNP）的表面形貌。圖2A表明，大部分納米管以小束或單管的形式分布于玻碳電極的表面。如圖2B所示，納米金在碳納米管表面的分布具有一致性，該納米結(jié)構(gòu)具有比表面積大、穩(wěn)定性好和傳導(dǎo)性高等優(yōu)點(diǎn)。

作為氧化還原探針，采用交流阻抗法考察了電極表面的修飾過程（圖3A）。裸玻碳電極的電子轉(zhuǎn)移阻抗值（Ret）約為160 Ω（曲線a），當(dāng)電極修飾碳納米管后， Ret明顯減小（曲線b）。電沉積納米金后，電極的導(dǎo)電性能進(jìn)一步提高（曲線c），表明CNT/AuNP復(fù)合膜作為良好的導(dǎo)電材料有效促進(jìn)了電子傳遞。當(dāng)antiMCLR與電極表面納米金結(jié)合后，抗體作為非導(dǎo)電性物質(zhì)阻礙了電子傳遞（曲線d），Ret明顯增大。依次加入MCLR與antiMCLRHRP后（曲線e，f），Ret逐步增大，證明二者先后結(jié)合在電極表面。

將修飾電極GCE/CNT/AuNP/antiMCLR/MCLR/antiMCLRHRP在不同條件下進(jìn)行循環(huán)伏安掃描用于測(cè)定電極表面HRP的電化學(xué)行為（圖3B）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該傳感器在空白PBS中具有很低的背景電流（曲線a）。在PBS中加入對(duì)苯二酚后，可以觀察到一對(duì)明顯的氧化還原峰（曲線b）。當(dāng)H2O2加入到上述溶液中后，還原峰峰電流明顯增加且峰電位向負(fù)方向移動(dòng)（曲線c），顯示了電極的催化特征，說明HRP已固定在免疫傳感器的表面并保持了良好的催化活性。

3.2免疫傳感器的性能比較

選用不同材料（CNTs，AuNPs，CNT/AuNP）分別修飾玻碳電極制備電化學(xué)免疫傳感器并比較其性能。圖4顯示CNT/AuNP復(fù)合膜修飾玻碳電極的電化學(xué)免疫傳感器獲得了最高響應(yīng)電流，表明CNT/AuNP復(fù)合膜對(duì)放大信號(hào)從而提高檢測(cè)靈敏度起著十分重要的作用。這是由于該復(fù)合膜具有一致的納米結(jié)構(gòu)，能夠增大電極的比表面積、增強(qiáng)機(jī)械穩(wěn)定性和導(dǎo)電性、增加了抗體在電極表面的固載量并可以保持其良好的生物活性。

3.3微囊藻毒素測(cè)定條件的優(yōu)化

溫度和時(shí)間是影響免疫反應(yīng)的重要因素。本研究在23～43 ℃范圍內(nèi)考察了溫度對(duì)電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)MCLR的影響。結(jié)果表明，隨著溫度升高，響應(yīng)電流逐步增強(qiáng)，在37 ℃獲得最大響應(yīng)電流。當(dāng)高于此溫度時(shí)，響應(yīng)電流下降，因此最佳免疫反應(yīng)溫度選擇37 ℃。同時(shí)，響應(yīng)電流隨著免疫反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，在60 min時(shí)，響應(yīng)電流趨于穩(wěn)定，因此最佳免疫反應(yīng)時(shí)間選擇60 min。

對(duì)苯二酚和H2O2的濃度是影響電化學(xué)酶催化分析的重要因素。實(shí)驗(yàn)表明，電流信號(hào)分別隨著兩者的濃度增大而增強(qiáng)，并且分別在0.50 mmol/L對(duì)苯二酚和0.80 mmol/L H2O2時(shí)達(dá)到最大電流值，因此對(duì)苯二酚和H2O2的最優(yōu)濃度選擇分別0.50和0.80 mmol/L。

3.4傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

在優(yōu)化條件下，對(duì)不同濃度的MCLR進(jìn)行測(cè)定（圖5）。響應(yīng)電流與MCLR濃度在0.50～12.0 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（圖5插圖），線性方程為Y （μA）=1.960+0.533X（μg/L）（R2=0.9952， n=5），檢出限達(dá)到0.30 μg/L（S/N=3）。結(jié)果表明，此電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)MCLR的靈敏度高，[TS（]圖5免疫傳感器對(duì)不同濃度MCLR的響應(yīng)（從a到f濃度分別為： 0.50， 2， 4， 7， 10， 12 μg/L）。

3.5傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性研究

對(duì)不同批次制備的免疫傳感器進(jìn)行了測(cè)試。對(duì)4個(gè)濃度（1，3，5和7 μg/L）MCLR分別測(cè)定5次，批內(nèi)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為5.3%，6.7%，6.9%和7.2%，批間的RSD分別為5.0%，7.5%，6.3%和4.8%，表明此傳感器具有良好的制備重現(xiàn)性。

將制備的免疫傳感器置于4 ℃冰箱保存1星期后，用于檢測(cè)10 μg/L MCLR，所得響應(yīng)電流值為初始值的95.2%；置于4 ℃冰箱保存3星期后，檢測(cè)10 μg/L MCLR，所得響應(yīng)電流值為初始值的87.9%，表明此傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

3.6干擾實(shí)驗(yàn)

淡水水體中其它藍(lán)藻毒素，如節(jié)球藻毒素、魚腥藻毒素a和石房蛤毒素等對(duì)MCLR的測(cè)定可能產(chǎn)生影響。在7 μg/L MCLR溶液中分別加入7 μg/L節(jié)球藻毒素、魚腥藻毒素a和石房蛤毒素，發(fā)現(xiàn)在其它藍(lán)藻毒素存在時(shí)，檢測(cè)MCLR產(chǎn)生的響應(yīng)電流信號(hào)（分別為5.42， 5.5和5.53 μA）與單獨(dú)測(cè)定MCLR產(chǎn)生的響應(yīng)電流信號(hào)（5.7 μA）相差不大，表明其它藍(lán)藻毒素的存在對(duì)MCLR的測(cè)定無明顯影響，證實(shí)了此傳感器具有良好的選擇性。

3.7樣品分析

分別取實(shí)驗(yàn)室自來水、桶裝飲用水、鎮(zhèn)江市玉帶河（水樣有一定濁度，測(cè)定之前用孔徑0.45 μm的濾膜抽濾水樣）和太湖水樣（水樣中有藻類殘余，且濁度較大，取樣后冰凍保存帶回，并保存在4 ℃冰箱中，測(cè)定前用孔徑0.45 μm的濾膜抽濾水樣），采用本方法分別檢測(cè)，結(jié)果見表1。利用標(biāo)準(zhǔn)加入法向其中加入適量MCLR進(jìn)行檢測(cè)，其回收率為93.0%～108.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.8%～5.0%，表明此電化學(xué)免疫傳感器用于實(shí)際水樣的檢測(cè)可靠性好、準(zhǔn)確度高。

4結(jié)論

基于CNT/AuNP復(fù)合膜發(fā)展了一種用于水體中MCLR檢測(cè)的電化學(xué)免疫傳感器。實(shí)驗(yàn)表明，CNT/AuNP復(fù)合膜能夠有效增強(qiáng)電極的導(dǎo)電性、增加抗體在電極表面的固載量并保持其良好的生物活性，對(duì)信號(hào)放大從而提高靈敏度起著重要的作用。此傳感器制備簡(jiǎn)單、可靠性好、準(zhǔn)確度高，對(duì)MCLR的檢測(cè)具有線性范圍寬、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)際水樣的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該電化學(xué)免疫傳感器技術(shù)在水體中MCLR檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。

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AbstractCarbon nanotubes/Au nanoparticles （CNT/AuNP） composite film was fabricated on glassy carbon electrode （GCE） by first dropping CNTs on the electrode surface and then electrodeposition of AuNPs by multipotential step. The antibody of microcystin（leucinearginine） （antiMCLR） was immobilized on the modified electrode surface through adsorption on AuNPs. Subsequently， bovine serum albumin （BSA） was used to block the nonspecific adsorption to obtain the immunosensor for MCLR assay. The immunosensor could effectively capture MCLR by the specific immunoreaction between the electrode surfaceconfined antibody and MCLR， followed by the attachment of the antiMCLR HRPlabeled to form a sandwichtype system. The analysis of MCLR was performed based on the catalytic reaction of HRP toward the oxidation of hydroquinone （QH2） by H2O2. Under the optimal experimental conditions， the peak current response increased linearly with the concentration of MCLR in the range of 0.50-12 μg/L with a detection limit of 0.30 μg/L （S/N=3）. The developed immunosensor was used to determine MCLR in real water samples， and the recoveries of standard addition experiments were in the range of 93.0%-108.5%， with the relative standard deviation of 3.8%-5.0%.

KeywordsMicrocystins； Carbon nanotubes/gold nanoparticles composite film； Electrochemical immunosensor

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AbstractCarbon nanotubes/Au nanoparticles （CNT/AuNP） composite film was fabricated on glassy carbon electrode （GCE） by first dropping CNTs on the electrode surface and then electrodeposition of AuNPs by multipotential step. The antibody of microcystin（leucinearginine） （antiMCLR） was immobilized on the modified electrode surface through adsorption on AuNPs. Subsequently， bovine serum albumin （BSA） was used to block the nonspecific adsorption to obtain the immunosensor for MCLR assay. The immunosensor could effectively capture MCLR by the specific immunoreaction between the electrode surfaceconfined antibody and MCLR， followed by the attachment of the antiMCLR HRPlabeled to form a sandwichtype system. The analysis of MCLR was performed based on the catalytic reaction of HRP toward the oxidation of hydroquinone （QH2） by H2O2. Under the optimal experimental conditions， the peak current response increased linearly with the concentration of MCLR in the range of 0.50-12 μg/L with a detection limit of 0.30 μg/L （S/N=3）. The developed immunosensor was used to determine MCLR in real water samples， and the recoveries of standard addition experiments were in the range of 93.0%-108.5%， with the relative standard deviation of 3.8%-5.0%.

KeywordsMicrocystins； Carbon nanotubes/gold nanoparticles composite film； Electrochemical immunosensor