毛冬青根提取液不同部位的血小板聚集抑制活性

林麗萍+李英+呂曄

摘要：采用萃取和柱層析法制備毛冬青各提取部位；用Born比濁法，以ADP為誘導(dǎo)劑檢測(cè)毛冬青根提取液各部位對(duì)血小板聚集的抑制率，從而確定毛冬青根抗血小板聚集的有效部位。結(jié)果表明，各部位均具有不同程度的抑制效果。其中水部位和D101-95%乙醇部位活性最強(qiáng)，且在0.08～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，隨著劑量的增加，其活性也隨之加強(qiáng)，抗血小板聚集活性與劑量呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：毛冬青；提取部位；抗血小板聚集

中圖分類號(hào)：R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0289-02

毛冬青為冬青科（Aquffoliaceae）冬青屬植物毛冬青（Ilex pubescens Hook.et Am.）的干燥根，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒之功效。已有研究結(jié)果表明毛冬青制劑有擴(kuò)張血管及抗菌消炎的作用，臨床用于冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病，血栓閉塞性脈管炎，并用于中心性視網(wǎng)膜炎，小兒肺炎等疾病的治療，有顯著療效^[1]。查閱大量文獻(xiàn)可知，當(dāng)前報(bào)道的毛冬青中具有抗血小板聚集活性的單體化合物有毛冬青甲素^[2]、毛冬青酸^[3-4]、Ilexosides D^[5]、Ilexosides J^[6]、Ilexgenin A、縮醛基毛冬青化合物R4^[7]、Pubescenosides A和Pubescenosides B^[8]8種。此外，筆者以Ilexgenin A為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，也得到了一系列具有抗血小板聚集活性的衍生物^[9]。然而，究竟毛冬青根提取液中哪個(gè)部位抗血小板聚集活性高，前人沒有做過詳細(xì)的研究。本研究利用萃取和柱層析的方法，獲得毛冬青根提取液的不同極性部位，以ADP為誘導(dǎo)劑，測(cè)定它們對(duì)血小板聚集的抑制效果，為后續(xù)有效成分的分離純化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

新西蘭大耳白兔♀兼用，體質(zhì)量1.7～2.0 kg，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。

1.2 藥物與試劑

毛冬青于2012年采自廣西，經(jīng)廣西藥用植物園韋發(fā)南研究員鑒定為毛冬青科冬青屬植物毛冬青（Ilex pubescens Hook.et Am.）的干燥根，留樣樣品保存在本所標(biāo)本館；柱層析硅膠和薄層層析硅膠（青島海洋化工有限公司產(chǎn)品）；阿司匹林（Sigma，貨號(hào)：A2093）；甲醇、正丁醇、二氯甲烷、乙醇、DMSO均為國(guó)產(chǎn)分析純（上海實(shí)意化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品）。

1.3 儀器

普通層析柱，超聲儀，型號(hào)KQ2200B，昆明市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；低溫離心機(jī)，型號(hào)1-15K，Sigma Corporation公司產(chǎn)品；血小板聚集儀，型號(hào)LBY-NJ，北京普利生儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 毛冬青提取液各部位的制備

將毛冬青根原材料粉碎后，70%乙醇回流提取3次，每次3 h，提取液濃縮得浸膏。浸膏水溶（1 kg ∶2 L）超聲懸浮得水懸浮液，依次用石油醚和水飽和的正丁醇萃取，得正丁醇部位和水部位。正丁醇部位減壓旋蒸、水浴蒸干，甲醇溶解上D101大孔樹脂柱，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇沖柱，得D101-水部位、D101-30%乙醇部位、D101-50%乙醇部位、D101-70%乙醇部位和D101-95%乙醇部位。取各部位分別濃縮蒸干后各取粉末5 mg，以0.5% DMSO作為溶媒，各部位分別配置0.08、0.20，0.50 mg/mL 3個(gè)濃度備用。

1.5 血小板聚集率測(cè)定

1.5.1 血漿樣品的制備

取健康新西蘭大耳白兔，靜脈注射20%烏拉坦1 g/kg 麻醉，頸總動(dòng)脈取血，以3.8%枸櫞酸鈉抗凝（血與抗凝劑體積比為9 ∶1）。室溫下1 000 r/min離心 15 min，吸取上層富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP），剩余血液3 000 r/min 離心15 min，吸取上清液貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）。制備好的PRP應(yīng)在3 h內(nèi)用完。

1.5.2 體外抗血小板聚集試驗(yàn)

取新西蘭大耳白兔，按“1.5.1”節(jié)方法制備PRP和PPP。用PPP調(diào)整PRP中血小板數(shù)為（3～4）×1011個(gè)/L。以0.5% DMSO作為溶媒對(duì)照，測(cè)定時(shí)以PPP調(diào)零。精密吸取15 μL溶媒或藥物溶液加入到270 μL PRP中，在37 ℃比濁杯內(nèi)孵育5 min，用PPP調(diào)零，再加入誘導(dǎo)劑 ADP 溶液15 μL（終濃度為10 μmol/L），按Born比濁法測(cè)定血小板聚集率，記錄5 min內(nèi)最大聚集率。血小板聚集抑制率=（對(duì)照組最大聚集率-藥物組最大聚集率）/對(duì)照組最大聚集率×100%。

1.5.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“x±s”表示，采用SPSS 18.0進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

與對(duì)照組相比，D101-70%乙醇部位0.2 mg/mL和 0.5 mg/mL 均顯著抑制ADP誘導(dǎo)的新西蘭大耳白兔血小板聚集（P<0.05），毛冬青浸膏、水部位、正丁醇部位、D101-水部位、D101-50%乙醇部位和D101-95%乙醇部位均極顯著抑制ADP誘導(dǎo)的新西蘭大耳白兔血小板聚集（P<0.01）（表1）。

3 討論

毛冬青是我國(guó)常用中藥之一，臨床應(yīng)用廣泛，在治療血栓方面表現(xiàn)出較好的療效。本試驗(yàn)結(jié)果表明，毛冬青具有顯著抗血小板聚集的活性，毛冬青浸膏、水部位、正丁醇部位、D101-水部位、D101-50%乙醇部位和D101-95%乙醇部位，均可極顯著地抑制血小板聚集，且呈劑量依賴關(guān)系；在 0.5 mg/mL 時(shí)，其抑制作用強(qiáng)度也均高于陽(yáng)性對(duì)照藥阿司匹林。在本次試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，水部位、D101-50%乙醇部位和D101-95%乙醇部位在抗血小板聚集方面較為顯著，因此可判定其抗血小板聚集的有效部位是水部位、D101-50%乙醇部位和D101-95%乙醇部位。下一步試驗(yàn)需對(duì)具有抗血小板聚集作用的有效部位進(jìn)一步分析，以期分離純化有效成分和探索其藥理作用。endprint

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