吳民熙，劉清術(shù)，劉前剛，單世平

湖南省微生物研究所，長沙 410009

中國油菜資源十分豐富，其榨油后副產(chǎn)物菜籽餅粕年產(chǎn)量約為800萬噸［1］，菜籽餅粕是一種優(yōu)良的有機(jī)肥料，蛋白質(zhì)含量高，富含氮、磷、有機(jī)質(zhì)，特別是對煙草的肥效優(yōu)于普通有機(jī)肥，在煙田間直接施用菜籽餅粕，可改善煙田土壤結(jié)構(gòu)，增加溫度促進(jìn)微生物活動(dòng)以及保蓄養(yǎng)分［2-6］，還有研究表明，配施不同形態(tài)菜籽餅肥的煙草，以施菜籽餅肥濾渣處理增加烤煙主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)方面效果明顯，其新植二烯、類胡蘿卜素降解物、類西柏烷化合物、美拉德反應(yīng)物、芳香族氨基酸降解物以及非新植二烯中性香氣物的含量最高［6］，但自然降解速度極慢，且肥效不易發(fā)揮。目前，大量試驗(yàn)證明，利用微生物發(fā)酵將菜籽粕中蛋白質(zhì)等大分子降解后，制成煙草專用生物有機(jī)肥施入煙田，有利于煙草合成較多的蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的合成和植株中香氣物質(zhì)的積累，從而形成較好的產(chǎn)量和品質(zhì)［7-9］。而長期以來，煙草專用生物有機(jī)肥研究過程中，功能菌一直存在著保質(zhì)期不夠長的問題，這主要是專用肥中高鹽環(huán)境影響了功能菌存活率。本研究將自制的含菜籽餅煙草專用生物有機(jī)肥的堆肥，露天堆肥腐熟10 d后，取6.8 kg置于20 L的塑料桶內(nèi)，蓋好頂蓋，保存6個(gè)月后，從發(fā)酵樣品中篩選得到3株能以菜籽餅為原料生長且具備較高耐鹽能力的菌株A2、A4、A7，并初步摸索和探討其在滅菌條件下單一菌株對菜籽餅的降解能力。所篩選的3株耐鹽菌株，為今后研制含菜籽餅的煙草專用生物有機(jī)肥延長保質(zhì)期提供了有利保證。

1 材料與方法

1.1 材料

市購菜籽餅:棕色，呈顆粒狀，將菜籽粕于70℃下烘干，粉碎40目過篩備用。煙草專用生物有機(jī)肥為湖南省微生物研究所植保組研制。

1.2 培養(yǎng)基

酪蛋白培養(yǎng)基:酪蛋白2%，用NaOH加熱濕潤，用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.2)定容至100 mL;完全培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、NaCl 1%、瓊脂1.5%，pH 7.2～7.5;液體發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉1.0%、菜籽餅 6%、MgSO4·7H2O 0.04%、KH2PO40.15%，pH 7.2～7.5。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的篩選

1.3.1.1 高產(chǎn)蛋白酶菌種初篩

取保存6個(gè)月生物有機(jī)肥樣品5 g，混于100 mL無菌水，取1 mL，稀釋1000倍，均勻涂布到酪蛋白培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后觀察，測菌落直徑(d，mm)和水解圈直徑(D，mm)，采用DP表示水解能力:DP=D-d。在酪蛋白培養(yǎng)基上挑取DP較大的菌落，再經(jīng)過四分區(qū)劃線，挑得單一菌落后保存。

1.3.1.2 高產(chǎn)蛋白酶菌種復(fù)篩

將分離純化的菌接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，170 rpm培養(yǎng)24 h，用以測定蛋白酶活力。以10%的接種量到菜籽粕液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后，將發(fā)酵液用離心機(jī)4000 rpm，離心10 min，取上清液1 mL，稀釋20倍，用福林法測定。

1.3.1.3 耐鹽菌的篩選

所篩高產(chǎn)蛋白酶的菌種接入液體完全培養(yǎng)基中，30℃下恒溫培養(yǎng)分別轉(zhuǎn)接到含5%、10%、15%、20%、25%NaCl的固體完全培養(yǎng)基上劃線，30℃下培養(yǎng)3 d，觀察生長情況，以確定細(xì)菌耐鹽程度［10］。

1.3.1.4 單一菌種發(fā)酵菜籽餅的初步摸索

將培養(yǎng)好的3個(gè)菌種的發(fā)酵液按接種量10%分別接入裝有已滅菌的100 g菜籽餅具棉花塞的500 mL錐形瓶中，放入35℃恒溫箱進(jìn)行固體發(fā)酵，每天上下翻動(dòng)數(shù)次，發(fā)酵5 d后用分別測定各個(gè)發(fā)酵樣品中粗蛋白、游離氨基酸、粗纖維、總糖、粗脂肪、灰分含量，發(fā)酵10 d后測定各個(gè)發(fā)酵樣品中的粗蛋白、游離氨基酸含量。

1.4 分析方法

1.4.1 蛋白酶活力

采用福林法測定。

1.4.2 發(fā)酵物中粗蛋白含量

取發(fā)酵物少許，125℃過夜烘干，碾磨成粉末狀，稱取0.4 g，加50 mL蒸餾水煮沸5 min，50℃下水浴保溫30 min，加10 mL 6%硫酸銅溶液，靜置過夜，過濾收集沉淀，用凱氏定氮法測定蛋白氮含量(硝化連同濾紙一起放人凱氏瓶內(nèi)硝化)。

粗蛋白含量=蛋白氮含量×6.25

1.4.3 其他物質(zhì)含量的測定

游離氨基酸含量，利用茚三酮法測定;總糖含量，蒽酮比色測定;粗纖維含量，采用酸堿法測定;粗纖維含量，用酸堿法測定;粗脂肪含量，用油重法測定;灰分含量，用灼燒法測定。

蛋白質(zhì)降解率(%)=［(發(fā)酵前蛋白質(zhì)含量-發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量)/發(fā)酵前蛋白質(zhì)含量］×100

1.4.4 16SrDNA分子水平菌種鑒定

根據(jù)已發(fā)表的16S rDNA序列設(shè)計(jì)保守的擴(kuò)增引物27F和1492R。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的篩選及菌種產(chǎn)蛋白酶活性的測定

利用酪蛋白培養(yǎng)基初篩出DP均大于8 mm的9個(gè)菌株 A1～A9，如圖1所示。

圖1 菌種水解酪蛋白情況Fig.1 Effect of different strains on hydrolysis of casein

再通過將所篩菌種接入液體完全培養(yǎng)基30℃恒溫培養(yǎng)，菌液用福林法測定蛋白酶活力，如圖2所示。

圖2 不同菌種液體培養(yǎng)產(chǎn)蛋白酶活力ig.2 Effect of different hydroponic strains on protease activity

2.2 耐鹽性菌種的篩選與單一菌種對菜籽餅降解程度的測定

由于菌種在固體和液體培養(yǎng)基中生長的耐鹽性表現(xiàn)可能不同，所以將所挑選蛋白酶活力較高的菌株 A2、A4、A6、A7，分離純化后，分別轉(zhuǎn)接到含 5%、10%、15%、20%、25%NaCl的固體和液體完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。固體完全培養(yǎng)基劃線，30℃下培養(yǎng)3 d，觀察生長情況，以確定細(xì)菌耐鹽程度;液體完全培養(yǎng)基以培養(yǎng)好的菌液稀釋5倍并以空白培養(yǎng)液(稀釋5倍)為對照，采用UV-1600分光光度計(jì)，在波長為600 nm下測定菌液的光密度。每一組菌液重復(fù)測量3次，取平均值。固體培養(yǎng)基生長情況如表1所示。

表1 耐鹽菌種在含鹽平板上生長情況Table 1 Result of salt-tolerant bacteria growth on salt flat

液體完全培養(yǎng)基生長情況如表2，NaCl含量5%、10%、15%、20%、25%的搖瓶培養(yǎng)72 h后觀察，每個(gè)菌種做3個(gè)平行，結(jié)果如表2所示。

表2 菌種 A2、A4、A6、A7耐鹽性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Effect of NaCl concentrations on strains A2，A4，A6 and A7

A6在含5%、10%NaCl的完全培養(yǎng)基中生長緩慢，耐鹽程度不高予以淘汰，A2、A4、A7在含5%、10%NaCl的完全培養(yǎng)基中生長良好。經(jīng)傳代10次以上后在10%NaCl的完全培養(yǎng)基能生長，說明此3種菌株的耐鹽性在遺傳上具有穩(wěn)定性，因此可作耐鹽菌予以保留并進(jìn)行菌種鑒定。

2.3 菌種的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察

經(jīng)過稀釋平板法觀察到菌株菌落乳白色，表面濕潤光滑，邊緣呈發(fā)射分支狀，在油鏡下觀察，菌株A2、A4、A7經(jīng)過12 h培養(yǎng)后細(xì)菌呈直桿狀，革蘭氏染色為陽性，48 h后細(xì)菌呈橢圓狀，革蘭氏染色為陰性，有芽孢，A2、A4芽孢呈卵圓，A7呈橢圓狀。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌鑒定手冊》初步確定為芽孢桿菌屬。

2.3.2 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

對3菌株進(jìn)行總DNA提取，PCR獲得16S rDNA基因交由生物公司測序，分別獲得菌株A2、A4、A7長度為1457、1460、1464 bp核苷酸序列。利用MEGA5.1軟件與NCBI數(shù)據(jù)庫中的DNA序列進(jìn)行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3～5)。結(jié)果表明，A2菌與解淀粉芽孢桿菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42)的同源性最高，為96%，初步鑒定其為解淀粉芽孢桿菌。A4菌與解淀粉芽孢桿菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42)的同源性最高，為88%，初步鑒定其為解淀粉芽孢桿菌，A7菌與栗褐芽孢桿菌(Bacillus badius strain 110)的同源性最高，為100%，初步鑒定其為栗褐芽孢桿菌。

圖3 菌株A2的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic analysis of strain A2based on 16S rDNA gene sequence

圖4 菌株A4的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic analysis of strain A4based on 16S rDNA gene sequence

圖5 菌株A7的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic analysis of strain A7based on 16S rDNA gene sequence

2.3.3 生理生化指標(biāo)測定

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［18］及《常見細(xì)菌鑒定手冊》中芽孢桿菌屬中各個(gè)種的特征，結(jié)合以上檢測到的生理生化特性及16S rDNA序列分析可以確定:A2和A4為解淀粉芽孢桿菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens strain);A7為栗褐芽孢桿菌菌株(Bacillus badius strain)。

表3 菌株的生理生化特征Table 3 Characteristics of strains A2，A4，A7in different physiological or biochemical reaction

2.4 單一菌種發(fā)酵降解菜籽餅的測定

以未發(fā)酵的菜籽餅粕作對照，經(jīng)檢測，粗蛋白含量為37.72%，游離氨基酸態(tài)氮含量為0.78%，粗纖維含量為24.72%，粗脂肪含量為6.08%，灰分為3.97%，總糖含量為1.68%，將本實(shí)驗(yàn)室篩選的3株菌種分別接種到已滅菌的菜籽餅中，發(fā)酵后5 d分別測定菜籽餅中粗蛋白、游離氨基酸、粗脂肪、粗纖維、灰分、總糖等含量，結(jié)果如下見圖6。

圖6 單一菌種發(fā)酵降解菜籽餅效果(第5 d)Fig.6 Fermentation result of single fungus in rapeseed cake(the 5thday)

由于菜籽餅中粗蛋白含量較高，在微生物分解作用下，粗蛋白被大幅度降解，分解成小肽和氨基酸，決定微生物降解菜籽餅?zāi)芰Φ闹匾笜?biāo)是粗蛋白的含量和游離態(tài)氨基酸的含量，因此，我們選定第10d主要測定粗蛋白和游離氨基酸這兩個(gè)指標(biāo)，結(jié)果見圖7。

圖7 單一菌種發(fā)酵降解菜籽餅效果(第10 d)Fig.7 Fermentation result of single fungus in rapeseed cake(the 10thday)

三菌株都是接入已滅菌的菜籽餅中，生長狀況更能體現(xiàn)單一菌種對基質(zhì)的降解能力和適應(yīng)性，根據(jù)測定數(shù)據(jù)可知，三個(gè)所篩選出的菌株在第5、10d對菜籽餅粗蛋白降解率最高的菌株都是A4，而A7最低，A4在第10d還達(dá)到17.6%，并且游離氨基酸含量達(dá)到1.54%，可能說明該解淀粉芽孢桿菌菌株A4在含硫代葡萄甙即芥子甙的菜籽餅中適應(yīng)能力比栗褐芽孢桿菌菌株A7強(qiáng)，而A2與A7菜籽餅粗蛋白降解率相近，A4與A7降解粗脂肪能力相似，這可能說明該同屬芽孢桿菌的不同種菌株降解菜籽餅粗蛋白、粗脂肪能力相當(dāng);A2、A4降解粗纖維的能力低于A7，這可能說明該同種的芽孢桿菌不同菌株降解菜籽餅粗纖維能力不同。

3 結(jié)論及展望

試驗(yàn)篩選出三種細(xì)菌，經(jīng)鑒定A2、A4為解淀粉芽孢桿菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens strain);A7為栗褐芽孢桿菌菌株(Bacillus badius strain)，其中，栗褐芽孢桿菌菌株能產(chǎn)生有機(jī)酸，對土壤中不溶性的無機(jī)磷具有較好降解能力，可作土壤溶磷菌肥的組成菌種;解淀粉芽孢桿菌菌株在含硫代葡萄甙即芥子甙的菜籽餅中有較強(qiáng)的生存能力，能分泌高活性的胞外酶系，具有很強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，其胞外酶可以降解某些復(fù)雜的植物性碳水化合物如羧甲基纖維素、粗脂肪、淀粉等，而在本研究中所選育解淀粉芽孢桿菌和栗褐芽孢桿菌對菜籽餅粗蛋白均表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解能力，解淀粉芽孢桿菌還表現(xiàn)出對菜籽餅液化能力，因此，對所得三個(gè)菌株的產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶等酶的活性有待于進(jìn)一步的研究，其耐鹽及分解菜籽餅?zāi)芰φ谶M(jìn)一步的開發(fā)中，據(jù)近期報(bào)道，解淀粉芽孢桿菌可以改善作物根際環(huán)境促進(jìn)作物生長及耐鹽能力［12］，因而具有很好的研究和應(yīng)用前景，這些研究都為利用菜籽餅生產(chǎn)煙草專用生物有機(jī)肥打下基礎(chǔ)。

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