胡姍姍，劉 云，郭丹妮，朱欣婷，田應(yīng)彪

1遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院;2遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心;3遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，遵義 563000

斑褐孔菌［Fuscoporia punctata(Fr.)Cunn］為多孔菌科(Polyporaceae)，褐孔菌屬(Fuscoporia)，又名層臥孔菌、斑點(diǎn)嗜藍(lán)孢孔菌，生于闊葉樹倒木上，主產(chǎn)于河北、吉林、江蘇、陜西等地［1，2］?，F(xiàn)代藥理研究表明斑褐孔菌具有抗心肌缺血、調(diào)節(jié)心率、改善心功能、降壓、阻滯腎上腺素能β-受體的作用，還具有凝血活性，可治療心絞痛、痛經(jīng)閉經(jīng)等疾癥［3-5］。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，課題組發(fā)現(xiàn)斑褐孔菌提取物表現(xiàn)出較好的體外抗腫瘤活性，課題組由此推測斑褐孔菌可能含有抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物。本研究對其極性較小的石油醚提取部分進(jìn)行了抗腫瘤活性的初探，旨在為后期捕捉具有抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物以及為其能在臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人肝癌細(xì)胞 SMMC-7721、人胃癌細(xì)胞 SGC-7901、人喉癌上皮細(xì)胞Hep-2由遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心饋贈，斑褐孔菌采自吉林省敦化市。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清，美國 Gibco公司;DMSO、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、Tris，美國Amresco公司;磺酰羅丹明，美國 Sigma公司;GenMed通用型細(xì)胞周期流式細(xì)胞分析試劑盒，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

702型超低溫冰箱、3131型CO2培養(yǎng)箱、全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo公司;R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司;倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS公司;H-7650型透射電鏡，日本日立公司;FACS Calibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 斑褐孔菌石油醚提取物的制備

斑褐孔菌子實(shí)體60℃烘干、粉碎、過60目篩。稱取斑褐孔菌粉末100 g，1 L石油醚60℃連續(xù)回流提取兩次，每次3 h。合并提取液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，自然干燥后得斑褐孔菌石油醚提取物(以下簡稱PEFP)200 mg。實(shí)驗(yàn)前精密稱取PEFP 10 mg，100 μL DMSO溶解，臨用前用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞 SMMC-7721、人胃癌細(xì)胞 SGC-7901、人喉癌上皮細(xì)胞Hep-2用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 SRB法測定PEFP的對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

取對數(shù)生長期SMMC-7721、SGC-7901、Hep-2細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為80000個/mL，每種細(xì)胞平行接種兩塊96孔板，分別為對照板(實(shí)驗(yàn)組:T0)和實(shí)驗(yàn)板(實(shí)驗(yàn)組:T)。每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，平板周圍一圈加入200 μL PBS，十字交叉搖勻，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h后，對照板細(xì)胞用預(yù)冷的50%三氯乙酸(TCA)固定，待測;同時實(shí)驗(yàn)板中加入 PEFP 100 μL(PEFP 終濃度分別為 10、20、40、60、80、100 μg/mL)，陰性對照孔(陰性對照組:C)加完全培養(yǎng)基，陽性對照空(順鉑:10 μg/mL)，每組設(shè)5個復(fù)

孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出培養(yǎng)板，TCA固定1 h，去離子水洗板，自然干燥，SRB染色，10 min后用醋酸洗板，自然干燥，200 μL Tris液溶解，530 nm 處測吸光度值(OD值)，按下列公式計(jì)算生長抑制率［6］。采用改良寇氏法計(jì)算PEFP對三種細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

Xm:lg最大劑量;I:lg(最大劑量/相臨劑量);P:陽性反應(yīng)率之和;Pm:最大陽性反應(yīng)率;Pn:最小陽性反應(yīng)率。

2.4 倒置相差顯微鏡觀察PEFP對SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為10000個/mL，取細(xì)胞懸液2 mL接種到25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)20 h后棄培養(yǎng)液，加入4 mL濃度為1/2 IC50的PEFP，并設(shè)陰性對照組。48 h后倒置相差顯微鏡觀察SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化情況。

2.5 透射電鏡觀察PEFP對SMMC-7721細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為10000個/mL，取細(xì)胞懸液2 mL接種到25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)20 h后棄培養(yǎng)液，加入4 mL濃度為1/2 IC50的PEFP，并設(shè)置陰性對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，4%戊二醛固定，透射電鏡待檢。

2.6 流式細(xì)胞儀分析PEFP對SMMC-7721細(xì)胞周期分布的影響

實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞處理及分組同實(shí)驗(yàn)方法2.5，每組三個重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。隨后按GenMed細(xì)胞周期試劑盒說明書操作。收集細(xì)胞，加入1 mL預(yù)冷的GenMed清理液，300 g離心5 min，棄上清液。加入500 μL 預(yù)冷的 GenMed 1 號工作液(由 500 μL GenMed裂解液和2.5 μL的GenMed染色液以及10 μL的GenMed去干擾劑組成)，小心混勻，避光孵育1 h，再加入 500 μL 2 號工作液(由 500 μL 的GenMed保存液和4 μL的GenMed染色液組成)，混勻;移入細(xì)胞流式儀專用測試管。流式細(xì)胞儀待檢。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 PEFP對三種腫瘤細(xì)胞增殖的影響

由表1可知，PEFP對 SMMC-7721、SGC-7901、Hep-2三種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較為明顯的抑制作用，抑制率隨PEFP濃度的增加逐漸上升，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。其中，PEFP對SMMC-7721的抑制作用最明顯，在40 μg/mL時，抑制率高達(dá)46.96%，而在100 μg/mL濃度時，細(xì)胞趨于完全死亡。濃度為80 μg/mL時，抑制率和陽性對照相當(dāng)。PEFP對三種細(xì)胞的 IC50分別為 52.72、69.18、58.88 μg/mL。

表1 PEFP對三種腫瘤細(xì)胞增殖的影響(±s，n=5)Table 1 Effect of PEFP on the proliferation of 3 tumor cells(±s，n=5)

表1 PEFP對三種腫瘤細(xì)胞增殖的影響(±s，n=5)Table 1 Effect of PEFP on the proliferation of 3 tumor cells(±s，n=5)

注:“-”表示無;*與陰性對照組比較，P＜0.05。Note:“- ”indicates not detected;* compare with negative control，P ＜0.05.

組別Group PEFP濃度PEFP concentration(μg/mL)SMMC-7721 SGC-7901 Hep-2 OD值OD value抑制率Inhibition rate(%)OD值OD value抑制率Inhibition rate(%)OD值OD value抑制率Inhibition rate(%)對照組Control(T0)- 0.26±0.00 - 0.31±0.00 0.25±0.00 -陰性對照組Negative control(C) - 1.41±0.05 - 1.41±0.03 1.68±0.07 -實(shí)驗(yàn)組Sample(T) 10 1.30±0.04* 9.57 1.29±0.03* 10.91 1.42±0.05* 18.18 20 1.16±0.06* 21.74 1.24±0.03* 15.45 1.35±0.06* 23.08 40 0.87±0.04* 46.96 1.11±0.04* 27.28 1.27±0.04* 28.67 60 0.62±0.06* 68.70 0.88±0.04* 48.19 0.90±0.06* 54.54 80 0.40±0.06* 86.96 0.77±0.03* 58.19 0.62±0.06* 74.13 100 0.28±0.01* 99.98 0.67±0.07* 62.28 0.47±0.02* 84.62順鉑Cis-platinum 10 0.46±0.05* 82.44 0.46±0.02* 86.50 0.57±0.01*77.37

3.2 PEFP對SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖1A所示，陰性對照組的細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞膜完整，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞貼壁緊密。而如圖1B所示，細(xì)胞經(jīng)1/2 IC50濃度的PEFP作用48 h后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞間的連接減少，細(xì)胞體積變小、變圓、變亮，大部分細(xì)胞凋亡或壞死，細(xì)胞膜破裂，懸浮在培養(yǎng)液中。

圖1 PEFP對SMCC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)Fig.1 Effect of PEFP on the cellular morphology of SMCC-7721(×100)

3.3 PEFP對SMMC-7721細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

細(xì)胞經(jīng)1/2 IC50濃度的PEFP作用48 h以后，對照組(圖2A)細(xì)胞核漿并無異常，胞質(zhì)內(nèi)染色質(zhì)豐富，可見多個核仁，胞漿內(nèi)線粒體豐富，嵴致密，絨毛結(jié)構(gòu)清晰;實(shí)驗(yàn)組(圖2B)細(xì)胞核明顯縮小，異染色質(zhì)消散，線粒體腫脹，空泡化，絨毛斷裂消失。

圖2 PEFP對SMCC-7721細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of PEFP on the cellular ultrastructure of SMCC-7721

3.4 PEFP對SMMC-7721細(xì)胞周期的影響

如表2和圖3所示，細(xì)胞經(jīng)1/2 IC50濃度的PEFP作用后，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞明顯減少。出現(xiàn)G0/G1期阻滯。

表2 PEFP對人肝癌細(xì)胞SMCC-7721細(xì)胞周期的影響(±s，n=3)Table 2 Effect of PEFP on the cell cycle of SMCC-7721(±s，n=3)

表2 PEFP對人肝癌細(xì)胞SMCC-7721細(xì)胞周期的影響(±s，n=3)Table 2 Effect of PEFP on the cell cycle of SMCC-7721(±s，n=3)

*:與陰性對照組比較，P＜0.05。*:Compare with Negative control，P ＜0.05.

組別Group PEFP濃度PEFP concentration(μg/mL)G0/G1(%)S(%)G2/M(%)陰性對照組Negative control 0 61.95±2.07 30.96±1.23 8.09±1.01實(shí)驗(yàn)組Sample 26.36 66.34±2.56*24.03±3.98*9.62±1.42

圖3 PEFP對SMCC-7721細(xì)胞DNA含量的影響Fig.3 Effect of PEFP on the DNA content of SMCC-7721

4 討論

斑褐孔菌在民間是作為一種用于治療冠心病的藥用真菌［7］，以它為原料制成的冠脈樂片已用于臨床治療心絞疼，但對于斑褐孔菌的藥用價值的研究和利用不應(yīng)僅限于此，還有待挖掘。本實(shí)驗(yàn)以石油醚為溶劑，提取其弱極性成分PEFP。利用SRB法證實(shí)了PEFP對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人喉癌上皮細(xì)胞Hep-2三種人惡性腫瘤細(xì)胞的體外增殖具有明顯的抑制作用，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。其中，PEFP對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制作用最強(qiáng)，IC50為52.72 μg/mL。細(xì)胞周期與腫瘤的關(guān)系是近年來抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)，人類惡性腫瘤的分子特征是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，引起細(xì)胞分化的缺乏和細(xì)胞生長的失常，導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖［8，9］。在實(shí)驗(yàn)中，課題組繼續(xù)考察了 PEFP 抑制SMMC-7721細(xì)胞體外增殖可能的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀監(jiān)測了PEFP對SMMC-7721細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)PEFP能使SMMC-7721細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少。由此推測PEFP能阻止SMMC-7721細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變，將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，從而阻斷細(xì)胞的生長與分裂，抑制細(xì)胞增殖，但引起SMMC-7721細(xì)胞G0/G1期阻滯的機(jī)制還有待研究。從Gl期進(jìn)入S期是細(xì)胞增殖周期中的一個限速位點(diǎn)，臨床使用的很多抗腫瘤藥物可以引起腫瘤細(xì)胞的G0/G1期阻滯［10］。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測，PEFP中可能會分離獲得高效抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖的單體化合物，此工作將會陸續(xù)開展。此次研究結(jié)果豐富了我國大型真菌斑褐孔菌的藥理活性研究內(nèi)容，并為進(jìn)一步的開發(fā)利用這一藥用真菌資源提供了理論依據(jù)。

1 Wu XL(吳興亮).Fungi of Tropical China(中國熱帶真菌).Beijing:Science Press，2009.584.

2 Mao XL(卯曉嵐).Macromycetes of China(中國蕈菌).Beijing:Science Press，2009.584.

3 Guo YM(郭豫梅)，Guo MJ(郭梅杰).Comparative research on flavonoid content in different fermentative productions of Fuscoporia punctata Cunn..Technl Dev Chem Ind(化工技術(shù)與開發(fā))，2008，37:9-11.

4 Li YJ(李永鑒).Blocking effect of Suscoporia punctata(Fr)Cunn tablet on β-receptor.J Fujian Coll Tradit Chin Med(福建中醫(yī)藥院學(xué)報(bào))，1993，3:227-229.

5 Liu PJ(劉鵬舉)，Shu Y(舒英)，Tang Y(唐詠)，et al.Coagulant activity of agglutinins for 17 kinds of fungi.J Liaoning Forest Sci Technol(遼寧農(nóng)業(yè)科技)，2009，1:37-38.

6 Vichai V，Kirtikara K.Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening.Nat Protoc，2006，1:1112-1116.

7 Ying JZ(應(yīng)建浙)，Mao XL(卯曉嵐)，Ma QM(馬啟明)，et al.Illustrates Handbook of Chinese Medicinal Mushroom(中國藥用真菌圖鑒).Beijing:Science Press，1987.167.

8 Hanahan D，Weinberg RA.The hallmarks of cancer.Cell，2000，100:57-70.

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