劉俊

摘要：目的 觀察穴位埋線對(duì)血管性癡呆（vascular dementia，VD）大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和血清抗凋亡因子（Livin）含量的影響，探討穴位埋線對(duì)VD大鼠腦缺血性損傷的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。 方法 將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、VD模型組、穴位埋線組、尼莫地平組，采用改良Pulsinellis四血管閉塞法（four-vessel occlusion，4-VO）建立VD大鼠模型，2個(gè)治療組分別施行穴位埋線和尼莫地平治療，連續(xù)15d，Morris水迷宮檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清Livin含量，制作海馬組織病理切片并進(jìn)行HE染色，觀察并比較各組大鼠學(xué)習(xí)能力、血清Livin含量及海馬神經(jīng)元損傷的變化。 結(jié)果 模型組表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，定位航行試驗(yàn)、空間探索試驗(yàn)與假手術(shù)組相比有顯著性差異（P<0.01）；與VD模型組比較，穴位埋線治療后VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著提高（P<0.05，P<0.01），血清Livin含量升高（P<0.05）。 結(jié)論 穴位埋線可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)理可能與埋線后提升血清Livin含量，進(jìn)一步抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。[KG）]

關(guān)鍵詞： 血管性癡呆；穴位埋線；學(xué)習(xí)記憶能力；抗凋亡因子；凋亡

中圖分類號(hào)： R245.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 ：A

文章編號(hào) ：1007-2349（2014）01-0059-03

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由一系列腦血管因素（缺血、出血、急慢性缺氧性腦血管病等）導(dǎo)致腦組織損害引起的以認(rèn)知功能障礙為特征的癡呆綜合征[1]，已成為威脅高齡人群生命的疾病之一。細(xì)胞凋亡是血管性認(rèn)知功能損害重要的病理生理機(jī)制，認(rèn)知功能損害程度與細(xì)胞凋亡有著直接的聯(lián)系。目前細(xì)胞凋亡在腦血管病發(fā)病機(jī)制中受到重視，多種細(xì)胞因子作為啟動(dòng)因素引起缺血性腦損傷。Livin是近年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein family，IAPs）家族新成員，具有較強(qiáng)的抗凋亡活性。本研究制備VD大鼠模型，采用穴位埋線治療，觀察VD大鼠血清Livin水平，探討穴位埋線治療VD的可能機(jī)制，為臨床治療VD提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠70只，體重280～300 g，清潔級(jí)，由重慶滕鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（渝）2007-0006。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)器材 可吸收性外科縫線（經(jīng)絡(luò)疏通專用線）（中國中醫(yī)研究院眾益科技開發(fā)公司）；電子天平（蘇州精密儀器廠）；DigBehv Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司）；微型動(dòng)脈夾（安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；SDQ-30雙極射頻電凝器（蘇州手術(shù)器械廠）；一次性1mL注射針頭、一次性5mL注射針頭（江西洪達(dá)醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司）。

1.1.3 藥品與試劑 水合氯醛、4%多聚甲醛、兔抗大鼠Livin抗體（美國R&D Systems 公司生產(chǎn)）檢測(cè)試劑盒（貴州平生生物技術(shù)有限公司提供）、尼莫地平片（正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：0801002）。

1.2 方法

1.2.1 VD大鼠模型的建立 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、VD模型組、穴位埋線組和尼莫地平組，采用改良的Pulsinellis四血管阻斷法（four-vessel occlusion，4-VO）建立VD大鼠模型[2]。模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠在4條血管阻斷后1-2 min內(nèi)，翻正反射消失，虹膜變白及瞳孔散大。

1.2.2 治療方法 術(shù)后第7天開始治療，除穴位埋線組外，其余各組治療均在每天上午9：00～11：00進(jìn)行，每日1次，連續(xù)治療15 d。

1.2.2.1 穴位埋線組 穴位選擇：百會(huì)、膈俞、氣海、三陰交、膻中。穴位定位：以《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》定位位置為標(biāo)準(zhǔn)[3]。治療方法：將可吸收性外科縫線（4～0號(hào)）剪成2 mm小段若干，放在已消毒紙上備用。使用時(shí)用鑷子將其裝入1 mL的注射針頭，然后再將預(yù)先剪去針尖的針灸針作為針芯穿入注射針頭內(nèi)，組成一套埋線工具。埋線時(shí)，先以碘酒消毒，乙醇脫碘后，將注射針頭刺入穴位，然后抵住針灸針針尾作注射狀，迅速將針頭內(nèi)的羊腸線推入穴內(nèi)，感覺注射針內(nèi)有空虛感時(shí)方可出針，并確認(rèn)羊腸線已埋入穴位內(nèi)。

1.2.2.2 尼莫地平組 按20 mg/（kg·d）的用量進(jìn)行灌胃治療。

1.2.2.3 假手術(shù)組、VD模型組均給予蒸餾水1 mL/100 g灌胃。

1.2.3 Morris 水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)[4]各組大鼠于術(shù)后第28 d開始水迷宮測(cè)試。Morris水迷宮為圓形水池，直徑100 cm，深50 cm，水深30 cm，水溫（24±2）℃，池壁上4個(gè)等距離點(diǎn)分水池為四個(gè)象限，選第三象限在其中央放置平臺(tái)，平臺(tái)無色透明，直徑6 cm，高28 cm，平臺(tái)沒于水面下2 cm，水池周圍參照物保持不變。第1～6 d進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)，每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的順序從各入水點(diǎn)（各象限水池壁中點(diǎn)）靠池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠從水中爬上站臺(tái)所需時(shí)間為逃避潛伏期；第7 d行空間探索實(shí)驗(yàn)，將大鼠從第Ⅰ象限入水點(diǎn)放入水池，記錄2 min內(nèi)大鼠在第Ⅲ象限游泳時(shí)間和穿越站臺(tái)次數(shù)。

1.2.4 血清采集及檢測(cè) Morris 水迷宮檢測(cè)之后，于腹股溝處切開皮膚，剪斷股動(dòng)脈采集血液，入冰箱靜置過夜后采集血清以備進(jìn)行Livin含量檢測(cè)。開顱取腦，取海馬組織固定12 h。經(jīng)梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋后，連續(xù)冠狀切片（片厚5 um）。蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察海馬神經(jīng)元的病理變化。

1.2.5 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Biomias99圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間差異比較采用SNK檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以以表示。endprint

2 結(jié)果

2.1 穴位埋線對(duì)VD大鼠Morris水迷宮的影響

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 平均逃避潛伏期反映大鼠的學(xué)習(xí)能力。模型組大鼠平均逃避潛伏期與假手術(shù)組比較明顯延長（P<0.05或P<0.01），穴位埋線組與模型組相比，平均逃避潛伏期縮短（P<0.01），與尼莫地平組無比較意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)反映了大鼠的記憶能力。VD模型組與假手術(shù)組比較，第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間縮短、穿越站臺(tái)次數(shù)減少（P<0.01），穴位埋線組與VD模型組比較，第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間延長、穿越站臺(tái)次數(shù)增多（P<0.01，P<0.05），穴位埋線組與尼莫地平組無比較意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

2.2 穴位埋線對(duì)VD大鼠血清livin含量的影響 VD模型組大鼠血清Livin含量比假手術(shù)組顯著降低（P<0.01），穴位埋線組大鼠血清Livin含量雖然也低于假手術(shù)組（P<0.05），但與VD模型組大鼠相比明顯升高（P<0.05），結(jié)果見表2。穴位埋線可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，提示其改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力與升高其血清Livin含量有關(guān)。

2.3 穴位埋線對(duì)VD大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響 HE染色見假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、密集，無變性、壞死和腫脹細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，胞漿豐富，無膠質(zhì)細(xì)胞增生現(xiàn)象；細(xì)胞核呈圓形、橢圓形。（見Fig.1圖A）；VD模型組海馬組織明顯水腫，血管擴(kuò)張充血，并見嚴(yán)重的神經(jīng)元腫脹、變性及壞死，神經(jīng)纖維增粗紊亂。（見Fig.1圖B）；穴位埋線組海馬CA1區(qū)現(xiàn)輕微水腫、血管擴(kuò)張充血，神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹及變性，未見神經(jīng)元排列紊亂和壞死。（見Fig.1圖C）；尼莫地平組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密集，出現(xiàn)輕微水腫和血管擴(kuò)張充血，神經(jīng)元現(xiàn)輕微腫脹和變性，未見神經(jīng)元排列紊亂和壞死，神經(jīng)纖維現(xiàn)增粗紊亂。（見Fig.1圖D）。

3 討論

近年來的研究表明，腦缺血可引起腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因的表達(dá)，并認(rèn)為細(xì)胞凋亡在缺血損傷中起重要作用。越來越多的證據(jù)表明：基因調(diào)控與細(xì)胞凋亡有關(guān)。影響細(xì)胞凋亡的基因按其表達(dá)物對(duì)凋亡過程的作用大致可分為兩類：存活基因和致死基因。Livin是一種新近發(fā)現(xiàn)的抗細(xì)胞凋亡因子，以其為靶點(diǎn)的抑制物及反義Livin能夠保護(hù)細(xì)胞不進(jìn)行凋亡[5]。還有報(bào)道稱Livin能夠作用于細(xì)胞凋亡線粒體通路，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[6]。抑制凋亡的的機(jī)制主要通過：抑制Caspasep途徑、激活TAK1/JNK1信號(hào)傳導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)[5]。譚家澤等[7]通過對(duì)Livin檢測(cè)顯示VD患者Livin含量降低，提示Livin低表達(dá)參與了VD的細(xì)胞凋亡進(jìn)程。張益等[8]對(duì)大鼠腦缺血再灌注腦組織Livin表達(dá)的研究顯示，假手術(shù)組、正常組Livin陽性細(xì)胞數(shù)量極低，模型組Livin陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，治療后，Livin陽性細(xì)胞數(shù)增加，表明通過增加Livin表達(dá)，可對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，減輕神經(jīng)元的丟失。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組VD大鼠Livin含量降低，與譚家澤的臨床試驗(yàn)結(jié)果相一致。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，埋線組可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，緩解海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷。

穴位埋線療法屬于針灸療法的一個(gè)分支，是經(jīng)絡(luò)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段相結(jié)合的產(chǎn)物，是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，采用不同型號(hào)的羊腸線，根據(jù)需要有選擇地埋入穴位，通過羊腸線對(duì)穴位的持續(xù)刺激作用，達(dá)到治療疾病的一種外治方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床各科[9]。由于VD是一種需要長期治療的疾病，目前針刺療效肯定，而穴位埋線每20～30 d治療1次，故避免需較長時(shí)間每日針刺的痛苦，使家屬及患者更能堅(jiān)持長期的治療，所以穴位埋線不失為一種較為切實(shí)的治療方法。中醫(yī)認(rèn)為，癡呆病人多屬本虛標(biāo)實(shí)，氣虛血瘀。氣虛則神失所養(yǎng)，瘀血?jiǎng)t可隨經(jīng)脈流行入腦，與精髓錯(cuò)雜，致使清竅受蒙，靈機(jī)呆鈍而出現(xiàn)神識(shí)不清，表情癡呆諸癥。筆者選取百會(huì)、膈俞、氣海、三陰交（雙）、膻中組成益氣活血方。百會(huì)為諸陽、百脈之會(huì)，可開竅醒神、回陽固脫。膈俞有開胸通膈治療氣滯血瘀之功。氣海培補(bǔ)元?dú)狻Ｈ幗豢山∑⒁鏆?，調(diào)補(bǔ)肝腎。膻中為氣會(huì)，有理肺氣、通乳絡(luò)之功。以上五穴共同組合，共奏益氣活血之功。本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，運(yùn)用穴位埋線治療實(shí)驗(yàn)性VD大鼠，觀察大鼠血清Livin含量變化與埋線治療的療效關(guān)系，為臨床運(yùn)用穴位埋線治療VD提供一定的理論依據(jù)。

Morris水迷宮已經(jīng)廣泛地用于動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶研究的實(shí)驗(yàn)。空間學(xué)習(xí)記憶是檢測(cè)動(dòng)物空間方向、反射時(shí)間、視知覺和結(jié)構(gòu)應(yīng)用等能力，從而評(píng)價(jià)其認(rèn)知水平的一種行為模式，是一類關(guān)于場景和事件的學(xué)習(xí)記憶，因能較好地檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶功能，并有排除動(dòng)物在完成作業(yè)而經(jīng)過的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素對(duì)其它動(dòng)物作業(yè)成績產(chǎn)生影響等優(yōu)點(diǎn)，因而在國內(nèi)外被廣泛采用[10]。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的4-VO建立VD模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠找到站臺(tái)的時(shí)間比對(duì)照組大鼠明顯延長；第7天撤去站臺(tái)后，VD模型組大鼠第Ⅲ象限游泳時(shí)間和穿越站臺(tái)次數(shù)比對(duì)照組明顯減少，結(jié)果表明，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較對(duì)照組明顯減退，應(yīng)用4-VO改良法成功復(fù)制了VD模型大鼠。采用穴位埋線治療后，大鼠找到站臺(tái)的時(shí)間較VD模型組明顯縮短，學(xué)習(xí)記憶成績接近對(duì)照組，提示穴位埋線能有效改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

結(jié)果顯示，VD模型組血清Livin顯著低于假手術(shù)組，穴位埋線組與VD模型組相比，具有顯著性差異（P<0.01），與尼莫地平組相比，無顯著性差異（P>0.05）。病理結(jié)果顯示，VD模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元嚴(yán)重受損，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力降低，穴位埋線組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元恢復(fù)良好，無嚴(yán)重變性和壞死，說明穴位埋線可緩解腦缺血性損傷的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而改善學(xué)習(xí)記憶。本研究結(jié)果表明，提升血清Livin含量，緩解腦缺血后細(xì)胞凋亡，減輕海馬神經(jīng)元的損傷，可能是穴位埋線改善癡呆癥狀的機(jī)理之一。

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[10]柯尊記，姚志彬.空間學(xué)習(xí)記憶的行為模式及其分子神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，1998，4（1）：1-7.endprint

2 結(jié)果

2.1 穴位埋線對(duì)VD大鼠Morris水迷宮的影響

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 平均逃避潛伏期反映大鼠的學(xué)習(xí)能力。模型組大鼠平均逃避潛伏期與假手術(shù)組比較明顯延長（P<0.05或P<0.01），穴位埋線組與模型組相比，平均逃避潛伏期縮短（P<0.01），與尼莫地平組無比較意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)反映了大鼠的記憶能力。VD模型組與假手術(shù)組比較，第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間縮短、穿越站臺(tái)次數(shù)減少（P<0.01），穴位埋線組與VD模型組比較，第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間延長、穿越站臺(tái)次數(shù)增多（P<0.01，P<0.05），穴位埋線組與尼莫地平組無比較意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

2.2 穴位埋線對(duì)VD大鼠血清livin含量的影響 VD模型組大鼠血清Livin含量比假手術(shù)組顯著降低（P<0.01），穴位埋線組大鼠血清Livin含量雖然也低于假手術(shù)組（P<0.05），但與VD模型組大鼠相比明顯升高（P<0.05），結(jié)果見表2。穴位埋線可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，提示其改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力與升高其血清Livin含量有關(guān)。

2.3 穴位埋線對(duì)VD大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響 HE染色見假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、密集，無變性、壞死和腫脹細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，胞漿豐富，無膠質(zhì)細(xì)胞增生現(xiàn)象；細(xì)胞核呈圓形、橢圓形。（見Fig.1圖A）；VD模型組海馬組織明顯水腫，血管擴(kuò)張充血，并見嚴(yán)重的神經(jīng)元腫脹、變性及壞死，神經(jīng)纖維增粗紊亂。（見Fig.1圖B）；穴位埋線組海馬CA1區(qū)現(xiàn)輕微水腫、血管擴(kuò)張充血，神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹及變性，未見神經(jīng)元排列紊亂和壞死。（見Fig.1圖C）；尼莫地平組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密集，出現(xiàn)輕微水腫和血管擴(kuò)張充血，神經(jīng)元現(xiàn)輕微腫脹和變性，未見神經(jīng)元排列紊亂和壞死，神經(jīng)纖維現(xiàn)增粗紊亂。（見Fig.1圖D）。

3 討論

近年來的研究表明，腦缺血可引起腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因的表達(dá)，并認(rèn)為細(xì)胞凋亡在缺血損傷中起重要作用。越來越多的證據(jù)表明：基因調(diào)控與細(xì)胞凋亡有關(guān)。影響細(xì)胞凋亡的基因按其表達(dá)物對(duì)凋亡過程的作用大致可分為兩類：存活基因和致死基因。Livin是一種新近發(fā)現(xiàn)的抗細(xì)胞凋亡因子，以其為靶點(diǎn)的抑制物及反義Livin能夠保護(hù)細(xì)胞不進(jìn)行凋亡[5]。還有報(bào)道稱Livin能夠作用于細(xì)胞凋亡線粒體通路，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[6]。抑制凋亡的的機(jī)制主要通過：抑制Caspasep途徑、激活TAK1/JNK1信號(hào)傳導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)[5]。譚家澤等[7]通過對(duì)Livin檢測(cè)顯示VD患者Livin含量降低，提示Livin低表達(dá)參與了VD的細(xì)胞凋亡進(jìn)程。張益等[8]對(duì)大鼠腦缺血再灌注腦組織Livin表達(dá)的研究顯示，假手術(shù)組、正常組Livin陽性細(xì)胞數(shù)量極低，模型組Livin陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，治療后，Livin陽性細(xì)胞數(shù)增加，表明通過增加Livin表達(dá)，可對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，減輕神經(jīng)元的丟失。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組VD大鼠Livin含量降低，與譚家澤的臨床試驗(yàn)結(jié)果相一致。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，埋線組可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，緩解海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷。

穴位埋線療法屬于針灸療法的一個(gè)分支，是經(jīng)絡(luò)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段相結(jié)合的產(chǎn)物，是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，采用不同型號(hào)的羊腸線，根據(jù)需要有選擇地埋入穴位，通過羊腸線對(duì)穴位的持續(xù)刺激作用，達(dá)到治療疾病的一種外治方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床各科[9]。由于VD是一種需要長期治療的疾病，目前針刺療效肯定，而穴位埋線每20～30 d治療1次，故避免需較長時(shí)間每日針刺的痛苦，使家屬及患者更能堅(jiān)持長期的治療，所以穴位埋線不失為一種較為切實(shí)的治療方法。中醫(yī)認(rèn)為，癡呆病人多屬本虛標(biāo)實(shí)，氣虛血瘀。氣虛則神失所養(yǎng)，瘀血?jiǎng)t可隨經(jīng)脈流行入腦，與精髓錯(cuò)雜，致使清竅受蒙，靈機(jī)呆鈍而出現(xiàn)神識(shí)不清，表情癡呆諸癥。筆者選取百會(huì)、膈俞、氣海、三陰交（雙）、膻中組成益氣活血方。百會(huì)為諸陽、百脈之會(huì)，可開竅醒神、回陽固脫。膈俞有開胸通膈治療氣滯血瘀之功。氣海培補(bǔ)元?dú)?。三陰交可健脾益氣，調(diào)補(bǔ)肝腎。膻中為氣會(huì)，有理肺氣、通乳絡(luò)之功。以上五穴共同組合，共奏益氣活血之功。本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，運(yùn)用穴位埋線治療實(shí)驗(yàn)性VD大鼠，觀察大鼠血清Livin含量變化與埋線治療的療效關(guān)系，為臨床運(yùn)用穴位埋線治療VD提供一定的理論依據(jù)。

Morris水迷宮已經(jīng)廣泛地用于動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶研究的實(shí)驗(yàn)。空間學(xué)習(xí)記憶是檢測(cè)動(dòng)物空間方向、反射時(shí)間、視知覺和結(jié)構(gòu)應(yīng)用等能力，從而評(píng)價(jià)其認(rèn)知水平的一種行為模式，是一類關(guān)于場景和事件的學(xué)習(xí)記憶，因能較好地檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶功能，并有排除動(dòng)物在完成作業(yè)而經(jīng)過的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素對(duì)其它動(dòng)物作業(yè)成績產(chǎn)生影響等優(yōu)點(diǎn)，因而在國內(nèi)外被廣泛采用[10]。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的4-VO建立VD模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠找到站臺(tái)的時(shí)間比對(duì)照組大鼠明顯延長；第7天撤去站臺(tái)后，VD模型組大鼠第Ⅲ象限游泳時(shí)間和穿越站臺(tái)次數(shù)比對(duì)照組明顯減少，結(jié)果表明，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較對(duì)照組明顯減退，應(yīng)用4-VO改良法成功復(fù)制了VD模型大鼠。采用穴位埋線治療后，大鼠找到站臺(tái)的時(shí)間較VD模型組明顯縮短，學(xué)習(xí)記憶成績接近對(duì)照組，提示穴位埋線能有效改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

結(jié)果顯示，VD模型組血清Livin顯著低于假手術(shù)組，穴位埋線組與VD模型組相比，具有顯著性差異（P<0.01），與尼莫地平組相比，無顯著性差異（P>0.05）。病理結(jié)果顯示，VD模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元嚴(yán)重受損，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力降低，穴位埋線組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元恢復(fù)良好，無嚴(yán)重變性和壞死，說明穴位埋線可緩解腦缺血性損傷的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而改善學(xué)習(xí)記憶。本研究結(jié)果表明，提升血清Livin含量，緩解腦缺血后細(xì)胞凋亡，減輕海馬神經(jīng)元的損傷，可能是穴位埋線改善癡呆癥狀的機(jī)理之一。

參考文獻(xiàn)：

[1]李 梨，周岐新，石京山.血管性癡呆研究概況[J].中國老年學(xué)雜志，2005；25：1269-1271.

[2]劉 燕，李衛(wèi)東，苗晉，等.電針對(duì)血管性癡呆大鼠腦組織MDA和AchE含量的影響[J].天津中醫(yī)藥，2008，25（6）：459-461.

[3]李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：184-185.

[4]Vorhees CV，W Il1iams M T.M orris water maze：procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory.Nat Protoc，2006；1（2）：848-858.

[5]Nachmias B，Ashhab Y，Buchohz V，et a1.Caspase-mediated cleavage conveFts Livin from an antiapoptotic to a proapoptotic factor：implications fordmg-resistantmelanoma[J].CancerRes，2003，63（19）：6340-6349.

[6]梁春艷，馬萍.凋亡抑制蛋白Livin抗癌新靶點(diǎn)[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2008，6（16）：1055-1057.

[7]譚家澤，蔡志友.血管性癡呆患者血清Livin、VEGF與IL-18、IFN-γ水平的臨床研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，9（34）：1246-1249.

[8]張益，蔡志友，晏勇.阿托伐他汀對(duì)大鼠腦缺血再灌注腦組織Livin、caspase 3表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)學(xué)，2009，9（37）：1112-1114.

[9]蒙珊，呂計(jì)寶，文小江.穴位埋線療法臨床應(yīng)用近況[J].山西中醫(yī)，2012，28（2）：56-58.

[10]柯尊記，姚志彬.空間學(xué)習(xí)記憶的行為模式及其分子神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，1998，4（1）：1-7.endprint

2 結(jié)果

2.1 穴位埋線對(duì)VD大鼠Morris水迷宮的影響

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 平均逃避潛伏期反映大鼠的學(xué)習(xí)能力。模型組大鼠平均逃避潛伏期與假手術(shù)組比較明顯延長（P<0.05或P<0.01），穴位埋線組與模型組相比，平均逃避潛伏期縮短（P<0.01），與尼莫地平組無比較意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)反映了大鼠的記憶能力。VD模型組與假手術(shù)組比較，第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間縮短、穿越站臺(tái)次數(shù)減少（P<0.01），穴位埋線組與VD模型組比較，第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間延長、穿越站臺(tái)次數(shù)增多（P<0.01，P<0.05），穴位埋線組與尼莫地平組無比較意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

2.2 穴位埋線對(duì)VD大鼠血清livin含量的影響 VD模型組大鼠血清Livin含量比假手術(shù)組顯著降低（P<0.01），穴位埋線組大鼠血清Livin含量雖然也低于假手術(shù)組（P<0.05），但與VD模型組大鼠相比明顯升高（P<0.05），結(jié)果見表2。穴位埋線可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，提示其改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力與升高其血清Livin含量有關(guān)。

2.3 穴位埋線對(duì)VD大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響 HE染色見假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、密集，無變性、壞死和腫脹細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，胞漿豐富，無膠質(zhì)細(xì)胞增生現(xiàn)象；細(xì)胞核呈圓形、橢圓形。（見Fig.1圖A）；VD模型組海馬組織明顯水腫，血管擴(kuò)張充血，并見嚴(yán)重的神經(jīng)元腫脹、變性及壞死，神經(jīng)纖維增粗紊亂。（見Fig.1圖B）；穴位埋線組海馬CA1區(qū)現(xiàn)輕微水腫、血管擴(kuò)張充血，神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹及變性，未見神經(jīng)元排列紊亂和壞死。（見Fig.1圖C）；尼莫地平組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密集，出現(xiàn)輕微水腫和血管擴(kuò)張充血，神經(jīng)元現(xiàn)輕微腫脹和變性，未見神經(jīng)元排列紊亂和壞死，神經(jīng)纖維現(xiàn)增粗紊亂。（見Fig.1圖D）。

3 討論

近年來的研究表明，腦缺血可引起腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因的表達(dá)，并認(rèn)為細(xì)胞凋亡在缺血損傷中起重要作用。越來越多的證據(jù)表明：基因調(diào)控與細(xì)胞凋亡有關(guān)。影響細(xì)胞凋亡的基因按其表達(dá)物對(duì)凋亡過程的作用大致可分為兩類：存活基因和致死基因。Livin是一種新近發(fā)現(xiàn)的抗細(xì)胞凋亡因子，以其為靶點(diǎn)的抑制物及反義Livin能夠保護(hù)細(xì)胞不進(jìn)行凋亡[5]。還有報(bào)道稱Livin能夠作用于細(xì)胞凋亡線粒體通路，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[6]。抑制凋亡的的機(jī)制主要通過：抑制Caspasep途徑、激活TAK1/JNK1信號(hào)傳導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)[5]。譚家澤等[7]通過對(duì)Livin檢測(cè)顯示VD患者Livin含量降低，提示Livin低表達(dá)參與了VD的細(xì)胞凋亡進(jìn)程。張益等[8]對(duì)大鼠腦缺血再灌注腦組織Livin表達(dá)的研究顯示，假手術(shù)組、正常組Livin陽性細(xì)胞數(shù)量極低，模型組Livin陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，治療后，Livin陽性細(xì)胞數(shù)增加，表明通過增加Livin表達(dá)，可對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，減輕神經(jīng)元的丟失。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組VD大鼠Livin含量降低，與譚家澤的臨床試驗(yàn)結(jié)果相一致。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，埋線組可以提升VD大鼠異常降低的血清Livin含量，緩解海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷。

穴位埋線療法屬于針灸療法的一個(gè)分支，是經(jīng)絡(luò)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段相結(jié)合的產(chǎn)物，是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，采用不同型號(hào)的羊腸線，根據(jù)需要有選擇地埋入穴位，通過羊腸線對(duì)穴位的持續(xù)刺激作用，達(dá)到治療疾病的一種外治方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床各科[9]。由于VD是一種需要長期治療的疾病，目前針刺療效肯定，而穴位埋線每20～30 d治療1次，故避免需較長時(shí)間每日針刺的痛苦，使家屬及患者更能堅(jiān)持長期的治療，所以穴位埋線不失為一種較為切實(shí)的治療方法。中醫(yī)認(rèn)為，癡呆病人多屬本虛標(biāo)實(shí)，氣虛血瘀。氣虛則神失所養(yǎng)，瘀血?jiǎng)t可隨經(jīng)脈流行入腦，與精髓錯(cuò)雜，致使清竅受蒙，靈機(jī)呆鈍而出現(xiàn)神識(shí)不清，表情癡呆諸癥。筆者選取百會(huì)、膈俞、氣海、三陰交（雙）、膻中組成益氣活血方。百會(huì)為諸陽、百脈之會(huì)，可開竅醒神、回陽固脫。膈俞有開胸通膈治療氣滯血瘀之功。氣海培補(bǔ)元?dú)?。三陰交可健脾益氣，調(diào)補(bǔ)肝腎。膻中為氣會(huì)，有理肺氣、通乳絡(luò)之功。以上五穴共同組合，共奏益氣活血之功。本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，運(yùn)用穴位埋線治療實(shí)驗(yàn)性VD大鼠，觀察大鼠血清Livin含量變化與埋線治療的療效關(guān)系，為臨床運(yùn)用穴位埋線治療VD提供一定的理論依據(jù)。

Morris水迷宮已經(jīng)廣泛地用于動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶研究的實(shí)驗(yàn)?？臻g學(xué)習(xí)記憶是檢測(cè)動(dòng)物空間方向、反射時(shí)間、視知覺和結(jié)構(gòu)應(yīng)用等能力，從而評(píng)價(jià)其認(rèn)知水平的一種行為模式，是一類關(guān)于場景和事件的學(xué)習(xí)記憶，因能較好地檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶功能，并有排除動(dòng)物在完成作業(yè)而經(jīng)過的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素對(duì)其它動(dòng)物作業(yè)成績產(chǎn)生影響等優(yōu)點(diǎn)，因而在國內(nèi)外被廣泛采用[10]。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的4-VO建立VD模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠找到站臺(tái)的時(shí)間比對(duì)照組大鼠明顯延長；第7天撤去站臺(tái)后，VD模型組大鼠第Ⅲ象限游泳時(shí)間和穿越站臺(tái)次數(shù)比對(duì)照組明顯減少，結(jié)果表明，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較對(duì)照組明顯減退，應(yīng)用4-VO改良法成功復(fù)制了VD模型大鼠。采用穴位埋線治療后，大鼠找到站臺(tái)的時(shí)間較VD模型組明顯縮短，學(xué)習(xí)記憶成績接近對(duì)照組，提示穴位埋線能有效改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

結(jié)果顯示，VD模型組血清Livin顯著低于假手術(shù)組，穴位埋線組與VD模型組相比，具有顯著性差異（P<0.01），與尼莫地平組相比，無顯著性差異（P>0.05）。病理結(jié)果顯示，VD模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元嚴(yán)重受損，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力降低，穴位埋線組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元恢復(fù)良好，無嚴(yán)重變性和壞死，說明穴位埋線可緩解腦缺血性損傷的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而改善學(xué)習(xí)記憶。本研究結(jié)果表明，提升血清Livin含量，緩解腦缺血后細(xì)胞凋亡，減輕海馬神經(jīng)元的損傷，可能是穴位埋線改善癡呆癥狀的機(jī)理之一。

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[3]李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：184-185.

[4]Vorhees CV，W Il1iams M T.M orris water maze：procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory.Nat Protoc，2006；1（2）：848-858.

[5]Nachmias B，Ashhab Y，Buchohz V，et a1.Caspase-mediated cleavage conveFts Livin from an antiapoptotic to a proapoptotic factor：implications fordmg-resistantmelanoma[J].CancerRes，2003，63（19）：6340-6349.

[6]梁春艷，馬萍.凋亡抑制蛋白Livin抗癌新靶點(diǎn)[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2008，6（16）：1055-1057.

[7]譚家澤，蔡志友.血管性癡呆患者血清Livin、VEGF與IL-18、IFN-γ水平的臨床研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，9（34）：1246-1249.

[8]張益，蔡志友，晏勇.阿托伐他汀對(duì)大鼠腦缺血再灌注腦組織Livin、caspase 3表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)學(xué)，2009，9（37）：1112-1114.

[9]蒙珊，呂計(jì)寶，文小江.穴位埋線療法臨床應(yīng)用近況[J].山西中醫(yī)，2012，28（2）：56-58.

[10]柯尊記，姚志彬.空間學(xué)習(xí)記憶的行為模式及其分子神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，1998，4（1）：1-7.endprint