楊振亞，盧丹逸，馬志國

(暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510632)

沙蓯蓉為列當(dāng)科植物沙蓯蓉Cistanche sinensis G.Beck 的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖［1］，具有溫陽益精、潤腸通便功效，用于腎虛陽衰癥、腸燥便秘，主要分布于陜西、甘肅、寧夏、青海、內(nèi)蒙古等地［2］。文獻(xiàn)報(bào)道，沙蓯蓉化學(xué)成分主要為苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷類以及多糖類化合物，苯乙醇苷類化合物是其中最重要的一類活性成分［1，3］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毛蕊花糖苷、金石蠶苷、2'-乙?；鹗Q苷為沙蓯蓉中主要的苯乙醇苷類成分［4］，其中，毛蕊花糖苷、金石蠶苷具有抗氧化活性［5-9］及神經(jīng)保護(hù)作用［10-13］。目前，有關(guān)沙蓯蓉中苯乙醇苷的提取工藝研究尚未見報(bào)道。因此，本研究以沙蓯蓉為原材料，以3個(gè)苯乙醇苷的提取率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)確定其最佳提取工藝，為進(jìn)一步開發(fā)和利用此藥材提供研究資料。

1 儀器與試藥

1.1 藥材 沙蓯蓉藥材購自廣州清平藥材市場，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥發(fā)展研究中心圖雅教授鑒定為Cistanche sinensis G.Beck的干燥肉質(zhì)莖。

1.2 試藥 甲醇 (上海晶純實(shí)業(yè)有限公司)為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為純凈水 (華潤怡寶食品飲料有限公司)，其他試劑均為分析純。毛蕊花糖苷、金石蠶苷和2'-乙?；鹗Q苷為實(shí)驗(yàn)室自制 (利用1H-NMR、13C-NMR、MS等波譜技術(shù)鑒定了化學(xué)結(jié)構(gòu))，HPLC檢出純度均大于98%。

1.3 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀，DAD檢測器，四元低壓梯度泵，在線真空脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱。KQ-250E型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);DFY-200搖擺式高級中藥粉碎機(jī) (溫嶺市中德中藥機(jī)械有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分的測定［4］

2.1.1 色譜條件 采用Agilent TC-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30℃;流動(dòng)相為甲醇 (A)-0.1%甲酸 (B)，梯度洗脫 (0 min，35%A;30 min，50%A)，體積流量1.0 mL/min，檢測波長330 nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 取對照品毛蕊花糖苷、金石蠶苷和2'-乙酰基金石蠶苷適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含毛蕊花糖苷、金石蠶苷、2'-乙?；鹗Q苷分別為1.07、5.17、4.98 mg的混合溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取正交試驗(yàn)各提取液，過微孔濾膜 (0.45 μm)，取續(xù)濾液，進(jìn)樣20 μL，按照上述色譜條件，測定，即得。

2.2 正交試驗(yàn) 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、溶劑用量 (B)、提取時(shí)間 (C)、提取次數(shù) (D)四個(gè)因素進(jìn)行考察，各因素均確定為三個(gè)水平，然后根據(jù)所制定的因素水平選用L9(34)正交表來安排試驗(yàn)，見表1。

表1 提取工藝因素水平

準(zhǔn)確稱取沙蓯蓉飲片9份，每份100 g，根據(jù)正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)條件，以各提取液中毛蕊花糖苷、金石蠶苷、2'-乙?；鹗Q苷3個(gè)指標(biāo)成分得量為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行工藝優(yōu)選。以9個(gè)試驗(yàn)中各指標(biāo)成分得量最大者計(jì)為10分，其余8個(gè)按比例折算，三個(gè)指標(biāo)得分之和計(jì)為總分，對結(jié)果進(jìn)行分析，得到表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

方差結(jié)果顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)四個(gè)因素均無顯著性差異，所以采用直觀分析。根據(jù)極差值，影響因素順序?yàn)锳＞B＞C＞D。乙醇體積分?jǐn)?shù) (A)為主要因素，且A3＞A2＞A1，故選其最優(yōu)水平A3;溶劑用量 (B)為次要因素，從極差分析B2與B3相當(dāng)，二者均明顯優(yōu)于B1，從節(jié)省角度考慮應(yīng)選B2;提取時(shí)間 (C)極差較小，從節(jié)省時(shí)間角度考慮應(yīng)選C1，但考慮到大生產(chǎn)時(shí)投料量大，提取效果差，提取時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長，且C2＞C3＞C1，故選擇提取時(shí)間C2;提取次數(shù)D極差較小，從極差分析D2與D3相當(dāng)，二者均明顯優(yōu)于D1，從節(jié)省角度考慮應(yīng)選D2;因此最佳提取工藝為A3B2C2D2，即分別用8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5 h。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取2份不同批次的沙蓯蓉飲片，每份200 g，按優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行提取，測定提取液中指標(biāo)成分的量。另外，采用文獻(xiàn) ［4］方法測定藥材中3個(gè)指標(biāo)成分的量，計(jì)算各指標(biāo)成分的提取率，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)

由表4可知，3個(gè)指標(biāo)成分提取率均大于71.56%，表明優(yōu)選的提取工藝提取率較高，工藝穩(wěn)定。

3 討論

3.1 沙蓯蓉中化學(xué)成分復(fù)雜，為了全面地評價(jià)提取工藝的優(yōu)劣，應(yīng)選擇活性成分作為指標(biāo)對工藝進(jìn)行評價(jià)。沙蓯蓉中苯乙醇苷類化合物是其最重要的一類活性成分，而毛蕊花糖苷、金石蠶苷、2'-乙酰基金石蠶苷又是其中的主要成分，因此選擇毛蕊花糖苷、金石蠶苷、2'-乙?；鹗Q苷作為指標(biāo)成分對工藝進(jìn)行評價(jià)。

3.2 本實(shí)驗(yàn)通過正交試驗(yàn)法對沙蓯蓉苯乙醇苷的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳提取工藝為用8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5 h。該工藝條件簡單可行，提取率較高，為進(jìn)一步開發(fā)利用沙蓯蓉提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］Tu P F，Shi H M，Song Z H，et al.Chemical constituents of Cistanche sinensis［J］.J Asian Nat Prod Res，2007，9(1):79-84.

［2］沈保安.中國常用中草藥［M］.合肥:安徽科技出版社，2005:326.

［3］Jiang Y，Li S P，Wang Y T，et al.Differentiation of Herba Cistanches by fingerprint with high-performance liquid chromatography-diode array detection-mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2009，1216(11):2156-2162.

［4］馬志國，甘穩(wěn)城.RP-HPLC同時(shí)測定沙蓯蓉中3種苯乙醇苷的含量［J］.藥物分析雜志，2012，24(7):1385-1387.

［5］Xiong Q，Hase K，Tezuka Y，et al.Acteoside inhibits apoptosis in D-galactosamine and lipopolysaccharide-induced liver injury［J］.Life Sci，1999，65(4):421-430.

［6］Chiou W F，Lin L C，Chen C F.Acteoside protects endothelial cells against free radical-induced oxidative stress［J］.J Pharm Pharmacol，2004，56(6):743-748.

［7］Lee K J，Woo E R，Choi C Y，et al.Protective effect of acteoside on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity［J］.Life Sci，2004，74(8):1051-1064.

［8］Tai B H，Jung B Y，Cuong N M，et al.Total Peroxynitrite scavenging capacity of phenylethanoid and flavonoid glycosides from the flowers of Buddleja officinalis［J］.Biol Pharm Bull，2009，32(12):1952-1956.

［9］He Z D，Lau K M，Xu H X，et al.Antioxidant activity of phenylethanoid glycosides from Brandisia hancei［J］.J Ethnopharmacol，2000，71(3):483-486.

［10］Koo K A，Kim S H，Oh T H，et al.Acteoside and its aglycones protect primary cultures of rat cortical cells from glutamate-induced excitotoxicity［J］.Life Sci，2006，79(7):709-716.

［11］Pu X，Song Z，Li Y，et al.Acteoside from Cistanche salsa inhibits apoptosis by 1-methyl-4-phenylpyridinium ion in cerebellar granule neurons［J］.Planta Med，2003，69(1):65-66.

［12］高 燕，蒲小平.類葉升麻苷抗魚藤酮致SH-SY5Y細(xì)胞損傷機(jī)制的研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(2):161-165.

［13］Koo K A，Sung S H，Park O H，et al.In vitro neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides from Callicarpa dichotoma［J］.Planta Med，2005，71(8):778-780.