應(yīng)用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)水體中的微藻

吳曉文

摘 要：為了探討流式細(xì)胞儀對(duì)不同濃度條件下微藻個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度和精密度，該文應(yīng)用流式細(xì)胞儀和血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)兩種方法，對(duì)水體中的赤潮異灣藻數(shù)目進(jìn)行不同濃度梯度的檢測(cè)對(duì)比分析，可以發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)結(jié)果的RSD值均小于5%，體現(xiàn)了更好的精密度，是一種可以代替血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的快速準(zhǔn)確的方法。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞儀 血球計(jì)數(shù)板 微藻 準(zhǔn)確度 精密度

中圖分類號(hào)：X835 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2014）07（a）-0196-01

Counting microalgae by flow cytometry

WU Xiaowen

（College of Ocean Science and Engineering，Shanghai Maritime University，Shanghai 201306，P.R.China）

Abstract：To discuss the accuracy and precision of microalgae counting by flow cytometry in different concentrations， this experiment researched two methods of flow cytometry and hemocytometer to make a comparative analysis about counting microalgae（Heterosigma akashiwo）in different concentrations.Flow cytometry gained RSD less than 5%，which is a fast and accurate method to replace hemocytometer.

Key words：flow cytometer Hemocytometer microalgae accuracy precision

細(xì)胞計(jì)數(shù)是醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域研究中的重要環(huán)節(jié)。其在了解細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、密度測(cè)定、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面具有十分重要的作用和影響。用于檢測(cè)單細(xì)胞微藻的方法多采用血球計(jì)數(shù)板法，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，重現(xiàn)性較差。為了提高檢測(cè)效率以及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，本文嘗試?yán)昧魇郊?xì)胞儀計(jì)數(shù)法，選取微型浮游植物赤潮異彎藻，通過用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法對(duì)不同濃度梯度的微藻溶液進(jìn)行計(jì)算值和實(shí)測(cè)值的對(duì)比分析，驗(yàn)證流式細(xì)胞儀對(duì)微藻計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度和精密度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

流式細(xì)胞儀染色劑Guava ViaCount（Merck Millipore），血球計(jì)數(shù)板（MARIENFELD），流式細(xì)胞儀（Partec CyFlow Cube），光學(xué)顯微鏡（XSP-8CA，上海），圓周振蕩器（Vortex 3，IKA）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法

取1 mL微藻懸液于離心管，加入160 ?L4%的戊二醛，震蕩搖勻后靜置5 min。試驗(yàn)中采用25×16格的血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下對(duì)稀釋后的微藻懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)。

其計(jì)算公式如下：?jiǎn)渭?xì)胞微藻數(shù)/mL=80小格內(nèi)微藻個(gè)數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法

取適量微藻培養(yǎng)液于離心管中振蕩均勻，從中移取400 ?L藻液至3.5 mL樣品管，加入適量染色劑振蕩混勻并避光存放30 min，取海水稀釋待測(cè)液至1.2 mL，混勻過濾后即可使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。

其計(jì)算公式如下：?jiǎn)渭?xì)胞微藻數(shù)/mL=儀器讀出的活體微藻數(shù)/測(cè)樣體積×1000×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 流式細(xì)胞儀的精確度分析

該文采用了傳統(tǒng)的血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)對(duì)比流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，每種方法重復(fù)3次，取平均值，兩種計(jì)數(shù)方法所得到的平均值非常接近，但是血球計(jì)數(shù)板多次計(jì)數(shù)所得到的各項(xiàng)數(shù)值偏離平均值的程度較大，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD約為5%，而流式細(xì)胞儀精確度較好，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2%，Eva L.Joachimsthal和Yingying Wang也在研究中提到了流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于5%，能得到比較可信的結(jié)果。

2.2 流式細(xì)胞儀的準(zhǔn)確度分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了幾組不同的濃度梯度，對(duì)異灣藻進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)測(cè)出的原始初樣濃度，進(jìn)行相應(yīng)稀釋度的理論計(jì)算和流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，如圖1所示，不同稀釋度的計(jì)算值和實(shí)際測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大都小于2%，擬合度比較好，說明流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的精確度很高，從圖中也可以看出，在不同稀釋度下的計(jì)算值和實(shí)際測(cè)量值之間的差值也非常小，表明流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)語

通過兩種計(jì)數(shù)方法的對(duì)比分析可以看出，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，解決了傳統(tǒng)方法計(jì)數(shù)中活體藻游動(dòng)和取樣過程帶來的隨機(jī)性問題，計(jì)數(shù)過程簡(jiǎn)便快捷，更適合實(shí)際應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] 侯建軍，黃邦欽，戴相輝.赤潮藻細(xì)胞計(jì)數(shù)方法比較研究[J].中國(guó)公共衛(wèi)生， 2004，20（8）：907-908.

[2] 陳坤，張前前，史海燕，等.浮游植物計(jì)數(shù)方法比較研究[J].海洋環(huán)境科學(xué)，2007，26（4）：383-385.

[3] 瞿唯鋼，魏方林，劉梅鳳，等.藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中藻細(xì)胞計(jì)數(shù)方法比較[J].農(nóng)藥， 2013，52（7）：497-502.

[4] Eva L.Joachimsthal，Volodymyr Ivanov，Joo-Hwa Tay，et al.Flow cytometry and conventional enumeration of microorganisms[J].Marine Pollution Bulletin，2003（46）：308-313.endprint

摘 要：為了探討流式細(xì)胞儀對(duì)不同濃度條件下微藻個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度和精密度，該文應(yīng)用流式細(xì)胞儀和血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)兩種方法，對(duì)水體中的赤潮異灣藻數(shù)目進(jìn)行不同濃度梯度的檢測(cè)對(duì)比分析，可以發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)結(jié)果的RSD值均小于5%，體現(xiàn)了更好的精密度，是一種可以代替血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的快速準(zhǔn)確的方法。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞儀 血球計(jì)數(shù)板 微藻 準(zhǔn)確度 精密度

中圖分類號(hào)：X835 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2014）07（a）-0196-01

Counting microalgae by flow cytometry

WU Xiaowen

（College of Ocean Science and Engineering，Shanghai Maritime University，Shanghai 201306，P.R.China）

Abstract：To discuss the accuracy and precision of microalgae counting by flow cytometry in different concentrations， this experiment researched two methods of flow cytometry and hemocytometer to make a comparative analysis about counting microalgae（Heterosigma akashiwo）in different concentrations.Flow cytometry gained RSD less than 5%，which is a fast and accurate method to replace hemocytometer.

Key words：flow cytometer Hemocytometer microalgae accuracy precision

細(xì)胞計(jì)數(shù)是醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域研究中的重要環(huán)節(jié)。其在了解細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、密度測(cè)定、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面具有十分重要的作用和影響。用于檢測(cè)單細(xì)胞微藻的方法多采用血球計(jì)數(shù)板法，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，重現(xiàn)性較差。為了提高檢測(cè)效率以及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，本文嘗試?yán)昧魇郊?xì)胞儀計(jì)數(shù)法，選取微型浮游植物赤潮異彎藻，通過用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法對(duì)不同濃度梯度的微藻溶液進(jìn)行計(jì)算值和實(shí)測(cè)值的對(duì)比分析，驗(yàn)證流式細(xì)胞儀對(duì)微藻計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度和精密度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

流式細(xì)胞儀染色劑Guava ViaCount（Merck Millipore），血球計(jì)數(shù)板（MARIENFELD），流式細(xì)胞儀（Partec CyFlow Cube），光學(xué)顯微鏡（XSP-8CA，上海），圓周振蕩器（Vortex 3，IKA）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法

取1 mL微藻懸液于離心管，加入160 ?L4%的戊二醛，震蕩搖勻后靜置5 min。試驗(yàn)中采用25×16格的血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下對(duì)稀釋后的微藻懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)。

其計(jì)算公式如下：?jiǎn)渭?xì)胞微藻數(shù)/mL=80小格內(nèi)微藻個(gè)數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法

取適量微藻培養(yǎng)液于離心管中振蕩均勻，從中移取400 ?L藻液至3.5 mL樣品管，加入適量染色劑振蕩混勻并避光存放30 min，取海水稀釋待測(cè)液至1.2 mL，混勻過濾后即可使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。

其計(jì)算公式如下：?jiǎn)渭?xì)胞微藻數(shù)/mL=儀器讀出的活體微藻數(shù)/測(cè)樣體積×1000×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 流式細(xì)胞儀的精確度分析

該文采用了傳統(tǒng)的血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)對(duì)比流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，每種方法重復(fù)3次，取平均值，兩種計(jì)數(shù)方法所得到的平均值非常接近，但是血球計(jì)數(shù)板多次計(jì)數(shù)所得到的各項(xiàng)數(shù)值偏離平均值的程度較大，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD約為5%，而流式細(xì)胞儀精確度較好，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2%，Eva L.Joachimsthal和Yingying Wang也在研究中提到了流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于5%，能得到比較可信的結(jié)果。

2.2 流式細(xì)胞儀的準(zhǔn)確度分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了幾組不同的濃度梯度，對(duì)異灣藻進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)測(cè)出的原始初樣濃度，進(jìn)行相應(yīng)稀釋度的理論計(jì)算和流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，如圖1所示，不同稀釋度的計(jì)算值和實(shí)際測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大都小于2%，擬合度比較好，說明流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的精確度很高，從圖中也可以看出，在不同稀釋度下的計(jì)算值和實(shí)際測(cè)量值之間的差值也非常小，表明流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)語

通過兩種計(jì)數(shù)方法的對(duì)比分析可以看出，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，解決了傳統(tǒng)方法計(jì)數(shù)中活體藻游動(dòng)和取樣過程帶來的隨機(jī)性問題，計(jì)數(shù)過程簡(jiǎn)便快捷，更適合實(shí)際應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] 侯建軍，黃邦欽，戴相輝.赤潮藻細(xì)胞計(jì)數(shù)方法比較研究[J].中國(guó)公共衛(wèi)生， 2004，20（8）：907-908.

[2] 陳坤，張前前，史海燕，等.浮游植物計(jì)數(shù)方法比較研究[J].海洋環(huán)境科學(xué)，2007，26（4）：383-385.

[3] 瞿唯鋼，魏方林，劉梅鳳，等.藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中藻細(xì)胞計(jì)數(shù)方法比較[J].農(nóng)藥， 2013，52（7）：497-502.

[4] Eva L.Joachimsthal，Volodymyr Ivanov，Joo-Hwa Tay，et al.Flow cytometry and conventional enumeration of microorganisms[J].Marine Pollution Bulletin，2003（46）：308-313.endprint

摘 要：為了探討流式細(xì)胞儀對(duì)不同濃度條件下微藻個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度和精密度，該文應(yīng)用流式細(xì)胞儀和血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)兩種方法，對(duì)水體中的赤潮異灣藻數(shù)目進(jìn)行不同濃度梯度的檢測(cè)對(duì)比分析，可以發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)結(jié)果的RSD值均小于5%，體現(xiàn)了更好的精密度，是一種可以代替血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的快速準(zhǔn)確的方法。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞儀 血球計(jì)數(shù)板 微藻 準(zhǔn)確度 精密度

中圖分類號(hào)：X835 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2014）07（a）-0196-01

Counting microalgae by flow cytometry

WU Xiaowen

（College of Ocean Science and Engineering，Shanghai Maritime University，Shanghai 201306，P.R.China）

Abstract：To discuss the accuracy and precision of microalgae counting by flow cytometry in different concentrations， this experiment researched two methods of flow cytometry and hemocytometer to make a comparative analysis about counting microalgae（Heterosigma akashiwo）in different concentrations.Flow cytometry gained RSD less than 5%，which is a fast and accurate method to replace hemocytometer.

Key words：flow cytometer Hemocytometer microalgae accuracy precision

細(xì)胞計(jì)數(shù)是醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域研究中的重要環(huán)節(jié)。其在了解細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、密度測(cè)定、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面具有十分重要的作用和影響。用于檢測(cè)單細(xì)胞微藻的方法多采用血球計(jì)數(shù)板法，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，重現(xiàn)性較差。為了提高檢測(cè)效率以及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，本文嘗試?yán)昧魇郊?xì)胞儀計(jì)數(shù)法，選取微型浮游植物赤潮異彎藻，通過用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法對(duì)不同濃度梯度的微藻溶液進(jìn)行計(jì)算值和實(shí)測(cè)值的對(duì)比分析，驗(yàn)證流式細(xì)胞儀對(duì)微藻計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度和精密度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

流式細(xì)胞儀染色劑Guava ViaCount（Merck Millipore），血球計(jì)數(shù)板（MARIENFELD），流式細(xì)胞儀（Partec CyFlow Cube），光學(xué)顯微鏡（XSP-8CA，上海），圓周振蕩器（Vortex 3，IKA）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法

取1 mL微藻懸液于離心管，加入160 ?L4%的戊二醛，震蕩搖勻后靜置5 min。試驗(yàn)中采用25×16格的血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下對(duì)稀釋后的微藻懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)。

其計(jì)算公式如下：?jiǎn)渭?xì)胞微藻數(shù)/mL=80小格內(nèi)微藻個(gè)數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法

取適量微藻培養(yǎng)液于離心管中振蕩均勻，從中移取400 ?L藻液至3.5 mL樣品管，加入適量染色劑振蕩混勻并避光存放30 min，取海水稀釋待測(cè)液至1.2 mL，混勻過濾后即可使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。

其計(jì)算公式如下：?jiǎn)渭?xì)胞微藻數(shù)/mL=儀器讀出的活體微藻數(shù)/測(cè)樣體積×1000×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 流式細(xì)胞儀的精確度分析

該文采用了傳統(tǒng)的血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)對(duì)比流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，每種方法重復(fù)3次，取平均值，兩種計(jì)數(shù)方法所得到的平均值非常接近，但是血球計(jì)數(shù)板多次計(jì)數(shù)所得到的各項(xiàng)數(shù)值偏離平均值的程度較大，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD約為5%，而流式細(xì)胞儀精確度較好，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2%，Eva L.Joachimsthal和Yingying Wang也在研究中提到了流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于5%，能得到比較可信的結(jié)果。

2.2 流式細(xì)胞儀的準(zhǔn)確度分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了幾組不同的濃度梯度，對(duì)異灣藻進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)測(cè)出的原始初樣濃度，進(jìn)行相應(yīng)稀釋度的理論計(jì)算和流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，如圖1所示，不同稀釋度的計(jì)算值和實(shí)際測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大都小于2%，擬合度比較好，說明流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的精確度很高，從圖中也可以看出，在不同稀釋度下的計(jì)算值和實(shí)際測(cè)量值之間的差值也非常小，表明流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)語

通過兩種計(jì)數(shù)方法的對(duì)比分析可以看出，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，解決了傳統(tǒng)方法計(jì)數(shù)中活體藻游動(dòng)和取樣過程帶來的隨機(jī)性問題，計(jì)數(shù)過程簡(jiǎn)便快捷，更適合實(shí)際應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] 侯建軍，黃邦欽，戴相輝.赤潮藻細(xì)胞計(jì)數(shù)方法比較研究[J].中國(guó)公共衛(wèi)生， 2004，20（8）：907-908.

[2] 陳坤，張前前，史海燕，等.浮游植物計(jì)數(shù)方法比較研究[J].海洋環(huán)境科學(xué)，2007，26（4）：383-385.

[3] 瞿唯鋼，魏方林，劉梅鳳，等.藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中藻細(xì)胞計(jì)數(shù)方法比較[J].農(nóng)藥， 2013，52（7）：497-502.

[4] Eva L.Joachimsthal，Volodymyr Ivanov，Joo-Hwa Tay，et al.Flow cytometry and conventional enumeration of microorganisms[J].Marine Pollution Bulletin，2003（46）：308-313.endprint