MicroRNA-29a、-133a在持續(xù)性房顫模型犬心房肌中的表達(dá)變化*

李發(fā)鵬， 張 健， 許國(guó)軍， 甘天翊， 湯寶鵬， 李耀東， 毛 婷， 姜 濤

在臨床實(shí)踐中，心房顫動(dòng)(atrial fibrillation，AF)是常見(jiàn)的心律失常之一。近年來(lái)隨著對(duì)房顫的臨床和基礎(chǔ)研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)重構(gòu)與老年持續(xù)性房顫密切相關(guān)，并且認(rèn)為，結(jié)構(gòu)重構(gòu)是房顫發(fā)生和維持的重要原因。而在結(jié)構(gòu)重構(gòu)中心房肌的纖維化被認(rèn)為是房顫發(fā)生的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［1］。房顫的發(fā)生隨心房纖維化程度的增加而增加，持續(xù)性房顫的維持和難以轉(zhuǎn)復(fù)與心房肌纖維化有關(guān)［2］。MicroR-NA(miRNA)是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)高度保守的、非編碼的、能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小分子RNA。近年來(lái)，miRNA在心臟的生長(zhǎng)發(fā)育以及心血管疾病發(fā)生發(fā)展中所起的作用日益為研究人員所關(guān)注，特別是心律失常方面。心肌細(xì)胞具有特異性的miRNA表達(dá)譜。而最新研究發(fā)現(xiàn)miRNA與心肌纖維化的關(guān)系很密切。miRNAs直接參與心肌纖維化，能直接作用于心臟成纖維細(xì)胞，調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞的存活［3］。MicroRNA-29a和-133a在心肌中特異性表達(dá)及與纖維化密切相關(guān)［4-5］。本研究通過(guò)制備犬持續(xù)性房顫模型，利用病理學(xué)及分子生物學(xué)方法檢測(cè)持續(xù)性房顫模型犬心房肌中膠原的分布情況以及microRNA-29a、-133a表達(dá)變化，探索持續(xù)性房顫與心房肌間質(zhì)纖維化及miRNA表達(dá)改變的關(guān)系。

材料和方法

1 對(duì)象

選用健康的成年比格犬10只，雌雄不限，犬齡平均(2.2±0.3)歲，體重(10.24±1.38)kg，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施均經(jīng)過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 分組和持續(xù)性房顫犬模型的建立 選用健康成年比格犬10只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(竇性心律)5只，持續(xù)性房顫模型組5只。為建立持續(xù)性房顫模型，選健康比格犬5只，記錄年齡、性別和體重，并行心臟超聲測(cè)量心房及心室大小。常規(guī)消毒手術(shù)器械及手術(shù)環(huán)境?；A(chǔ)麻醉后行氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸。動(dòng)態(tài)記錄犬正常II導(dǎo)聯(lián)心電圖。犬右側(cè)臥位，打開(kāi)心包，暴露左心耳，將起搏電極縫合固定于左心耳的底部。用起搏分析儀測(cè)量各項(xiàng)電參數(shù)(電壓閾值＜1 V，阻抗500～1 000Ω)，然后將電極尾端與實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物埋藏式高頻心臟起搏器(上海復(fù)旦大學(xué)電子工程系制造)相連，用Lead-2000多道電生理記錄儀描記標(biāo)準(zhǔn)體表心電圖，磁鐵靠近后開(kāi)啟起搏器，觀察起搏器工作狀態(tài)，若起搏功能良好，快速起搏后出現(xiàn)心房顫動(dòng)，每分鐘約600次，關(guān)閉起搏器，檢查心包、胸腔出血情況，將起搏器埋藏于胸部皮下囊袋內(nèi)。觀察犬的癥狀及體征。犬的一般情況穩(wěn)定后開(kāi)啟起搏器予以連續(xù)起搏4周左右，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)心電圖證實(shí)為持續(xù)性心房顫動(dòng)，持續(xù)時(shí)間大于15 min的心房顫動(dòng)定義為持續(xù)性心房顫動(dòng)［6］。假手術(shù)組埋置起搏器后不起搏。模型建立成功后，使用心臟超聲儀分別測(cè)量2組犬的心臟結(jié)構(gòu)，包括左右心房、心室的大小及射血分?jǐn)?shù)等參數(shù)。由于正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了充分的預(yù)實(shí)驗(yàn)，因此本次實(shí)驗(yàn)較為成功。假手術(shù)組犬全部順利完成實(shí)驗(yàn)，慢性房顫模型組犬中有5只順利完成實(shí)驗(yàn)，有1只因?yàn)樾g(shù)后感染、囊袋血腫于術(shù)后1周左右死亡。持續(xù)性房顫模型組犬在快速起搏8周以后，有3只(60%)出現(xiàn)自發(fā)性房顫，須經(jīng)直流電復(fù)律或迷走刺激方能終止。采用程序刺激，4只(80%)可誘發(fā)出持續(xù)性房顫，平均房顫持續(xù)時(shí)間(45±12)min。采用高頻Burst刺激全部(100%)誘發(fā)出持續(xù)性房顫，平均房顫持續(xù)時(shí)間(52±14)min。在無(wú)菌狀態(tài)下取左心房組織并保存于液氮中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 Masson三色法染色鑒定持續(xù)性房顫模型犬左心房組織纖維化程度 建模成功后取左心房游離壁，生理鹽水漂洗干凈，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片。Masson三色法染色(福州邁新)，彩色圖像分析系統(tǒng)計(jì)算出膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)=膠原面積/全視野面積×100%。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)左心房組織中microRNA-29a及microRNA-133a表達(dá)的水平 。建模成功后取100 mg左心房組織，用Trizol(Invitrogen)一步法提取總RNA。取2μg總RNA參照逆反錄試劑盒(Promega)進(jìn)行操作逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物由Gene Copoeia公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences for primers

采用染料法(SYBR Green I)進(jìn)行相對(duì)定量分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是按照ΔΔCt解析法來(lái)進(jìn)行。Real-time PCR體系(20 μL):待測(cè)樣品cDNA稀釋5倍，然后取 cDNA 2 μL，2 × All-in-OneTMqPCR mix 10 μL(Gene Copoeia)，PCR forward primer(2 μmol/L)2 μL，universal adaptor PCR primer(2 μmol/L)2 μL，ddH2O 4 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min，隨后進(jìn)入PCR循環(huán)，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后利用iQ5 real-time PCR Detection System(Bio-Rad)根據(jù) Ct值計(jì)算 2-ΔΔCt得出目的microRNA相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 2組犬超聲心動(dòng)圖資料比較

1.1 假手術(shù)組犬與持續(xù)性房顫模型組犬造模前超聲心動(dòng)圖資料比較 假手術(shù)組犬與持續(xù)性房顫模型組犬比較均未發(fā)現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)有明顯異常，與假手術(shù)組犬相比，持續(xù)性房顫模型組犬超聲心動(dòng)圖指標(biāo)如:左心房?jī)?nèi)徑、右心房?jī)?nèi)徑、左心室內(nèi)徑、右心室內(nèi)徑、右心室流出道內(nèi)徑和射血分?jǐn)?shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 假手術(shù)組犬和持續(xù)性房顫模型組犬超聲心動(dòng)圖資料比較Table 2.The dog echocardiographic data comparison of the control and persistent atrial fibrillation model group(Mean±SD.n=5)

1.2 持續(xù)性房顫模型組犬造模前后超聲心動(dòng)圖資料比較 持續(xù)性房顫模型組犬造模前后相比，左、右心房?jī)?nèi)徑和射血分?jǐn)?shù)與造模前比較無(wú)明顯差異，左心室內(nèi)徑、右心室內(nèi)徑和右心室流出道內(nèi)徑等變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表3 持續(xù)性房顫模型組犬造模前后超聲心動(dòng)圖資料比較Table 3.The echocardiography data comparison of persistent AF group and before modeling(Mean±SD.n=5)

2 Masson三色染色結(jié)果

通過(guò)染色后在光鏡下我們可以觀察到:膠原纖維、黏液等呈現(xiàn)出藍(lán)色，細(xì)胞核呈現(xiàn)出黑藍(lán)色，而胞漿、胞質(zhì)、肌纖維和纖維素等呈現(xiàn)出紅色。假手術(shù)組即竇性心律組心房肌主要以紅色的肌纖維為主，并且排列整齊，藍(lán)色的膠原纖維分布較少，分布在血管周?chē)?，?jiàn)圖1。持續(xù)性房顫模型組心房肌，心肌纖維間隙增寬，并且排列紊亂，相互交織，藍(lán)色的膠原纖維顯著增多，見(jiàn)圖2。分別計(jì)算假手術(shù)組及持續(xù)性房顫模型組犬左心房心肌中膠原容積分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)持續(xù)性房顫模型組心房肌中的膠原容積分?jǐn)?shù)明顯高于假手術(shù)組，見(jiàn)表4。

表4 假手術(shù)組和持續(xù)性房顫模型組CVF比較Table 4.The comparison of CVF between control group and persistent atrial fibrillation model group(Mean±SD.n=5)

Figure 1.Masson staining of atrium section in control group(×200).圖1 假手術(shù)組Masson染色

Figure 2.Masson staining of atrium section in persistent atrial fibrillation model group(×200).圖2 持續(xù)性房顫模型組Masson染色

3m iRNAs的表達(dá)

假手術(shù)組與持續(xù)性房顫模型組心房肌中2種miRNAs表達(dá)含量見(jiàn)表5。與假手術(shù)組相比，持續(xù)性房顫模型組心房肌組織中microRNA-29a及microRNA-133a表達(dá)水平明顯下降。

表5 2組犬左心房肌組織中miR-133a和miR-29a表達(dá)量的比較Table 5.The comparison of expression of miR-133a and miR-29a in left atrium muscle organization between control group and persistent atrial fibrillation model group(Mean±SD.n=5)

討 論

大量研究表明，心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)在房顫的發(fā)生及維持過(guò)程中起重要作用。心房電重構(gòu)在持續(xù)性房顫復(fù)律后短時(shí)間內(nèi)并非完全消失，由于結(jié)構(gòu)重構(gòu)持續(xù)存在［7-8］，這時(shí)房顫有可能再度發(fā)生。因此，心房電重構(gòu)在房顫最初階段起部分作用，后期則是心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)起作用［9］。心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)表現(xiàn)為心房肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，如心房擴(kuò)大、心房肌間質(zhì)的纖維化。并且有研究表明心房容積的大小與房顫的穩(wěn)定性顯著正相關(guān)，心房擴(kuò)大后使得房顫復(fù)律后更易復(fù)發(fā)。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)持續(xù)性房顫模型組犬在成模后與造模前相比，左右心房?jī)?nèi)徑有增大趨勢(shì)，射血分?jǐn)?shù)降低，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后射血分?jǐn)?shù)降低可能是房顫時(shí)心房擴(kuò)大導(dǎo)致心房主動(dòng)收縮功能喪失，心房射血量降低，從而導(dǎo)致心室充盈量減少，同時(shí)房顫時(shí)心室率增快，心律絕對(duì)不規(guī)則，舒張期縮短，左室充盈量受限，因此射血分?jǐn)?shù)下降。另外，房顫的持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，心房擴(kuò)大越明顯，但因造模時(shí)間較短，房顫持續(xù)時(shí)間較短，心房?jī)?nèi)徑呈增大趨勢(shì)，但增大的幅度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

心房肌的纖維化是結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要表現(xiàn)，也是房顫發(fā)生的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。心肌纖維化表現(xiàn)為膠原合成代謝和分解代謝失衡。當(dāng)膠原降解平衡被打破后，導(dǎo)致心肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成與降解的動(dòng)態(tài)失衡，促使大量ECM積聚而沉積在心肌細(xì)胞間質(zhì)中，并使心肌細(xì)胞排列錯(cuò)亂，導(dǎo)致了心肌纖維化的發(fā)生。該實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，持續(xù)性房顫模型組犬左心房心肌組織中膠原成份明顯增多，粗細(xì)纖維混亂交織，排列紊亂，其中以粗纖維為主。并且通過(guò)計(jì)算其膠原容積分?jǐn)?shù)后，持續(xù)性房顫模型組犬的膠原容積分?jǐn)?shù)較假手術(shù)組明顯增高。從組織病理學(xué)上證實(shí)了持續(xù)性房顫模型組纖維化程度明顯加重，證實(shí)了心房纖維化是房顫發(fā)生及維持的重要基質(zhì)，這與既往的研究一致。

miRNAs在心血管疾病的發(fā)育以及病理生理過(guò)程中扮演著十分重要的角色［10］。在某些如擴(kuò)張型心肌病、缺血性心肌病、心肌梗死等病理狀態(tài)下，miR-1、miR-21、miR-29、miR-30、miR-208、miR-320 及 miR-199a等可促進(jìn)或抑制心肌纖維化的形成，參與心律失常發(fā)生［3，11-15］。國(guó)外學(xué)者將 Smad3-/-小鼠和正常小鼠經(jīng)過(guò)主動(dòng)脈縮窄后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，小鼠的心肌纖維化程度減少大約60%，并檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌中miRNA-29a表達(dá)水平較對(duì)照組增高，提示miRNA-29a有抑制心肌纖維化的作用，機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Smad3通路相關(guān)［16］。并有研究發(fā)現(xiàn)在心肌梗死小鼠模型和心?；颊叩墓Ｋ肋吘墡募〗M織中miR-29的表達(dá)水平明顯下降，并將miR-29低表達(dá)后發(fā)現(xiàn)心肌組織中最多的Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白和原纖蛋白mRNA水平上調(diào)，心肌組織中膠原含量增高，纖維化程度加重，心肌重塑增加，均表明了miR-29參與了心肌纖維化過(guò)程［14］。Duisters 等［15］研究發(fā)現(xiàn)miR-133過(guò)表達(dá)可使結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)mRNA表達(dá)水平下降，減少心肌膠原蛋白的生成，抑制心肌纖維化，并推測(cè)在CTGF的mRNA的3′末端存在miR-133的靶點(diǎn)。最近的一項(xiàng)報(bào)道發(fā)現(xiàn)煙草中的尼古丁成分可以使房顫模型犬及吸煙的房顫患者心肌中miR-133下調(diào)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)使其下調(diào)的原因是心肌中TGF-β1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體Ⅱ (TGF-βRⅡ)信使RNA的降解減少了，使得心肌成纖維細(xì)胞增生，膠原合成增加，膠原蛋白含量升高，心肌纖維化程度加重，促進(jìn)了心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，從而與房顫的發(fā)生及維持密切相關(guān)［12］。張瑩等［17］通過(guò)制備犬持續(xù)性房顫模型，應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析了犬房顫心肌中10個(gè)miRNAs的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了其中4個(gè)上調(diào)，6個(gè)下調(diào)，其中miR-133a的表達(dá)水平下調(diào)，提示miR-133a可能通過(guò)影響心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)參與了持續(xù)性房顫的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性房顫模型組犬左心房組織miR-29a及miR-133a表達(dá)明顯降低，這與既往的研究是一致的，表明它們是與纖維化密切相關(guān)的因子之一，在心房纖維化形成中發(fā)揮了潛在作用，與房顫的發(fā)生及維持密切相關(guān)。其表達(dá)水平下調(diào)后可促進(jìn)纖維化，可能是通過(guò)影響膠原蛋白、纖維蛋白以及彈性蛋白的表達(dá)，使其合成增加，調(diào)節(jié)TGF-β/Smad、CTGF等多條與纖維化相關(guān)的信號(hào)通路，使致纖維化因子大量釋放共同作用的結(jié)果。

MicroRNAs的出現(xiàn)為人們進(jìn)一步研究房顫的發(fā)病機(jī)制提供了全新的視角。并且有研究者提出“miRNAs調(diào)控失衡致心律失常假說(shuō)”，心房肌中miRNA表達(dá)失衡，可導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)，心肌細(xì)胞發(fā)生電活動(dòng)紊亂，誘發(fā)各種心律失常。該實(shí)驗(yàn)初步探索到miR-29a、-133a可能在心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，通過(guò)上調(diào)或下調(diào)其表達(dá)水平，抑制纖維化發(fā)生，減少房顫的發(fā)生與維持時(shí)間，為房顫的治療提供了理論依據(jù)，但它們具體的作用靶基因及調(diào)控機(jī)制和藥物研發(fā)有待進(jìn)一步研究。

［1］ Everett TH 4th，Olgin JE.Atrial fibrosis and the mechanisms of atrial fibrillation［J］.Heart Rhythm，2007，4(3 Suppl):S24-S27.

［2］ Lévy S，Sbragia P.Remodelling in atrial fibrillation［J］.Arch Mal Coeur Vaiss，2005，98(4):308-312.

［3］ Thum T，Gross C，F(xiàn)iedler J，et al.MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts［J］.Nature，2008，456(7224):980-984.

［4］ Chen S，Puthanveetil P，F(xiàn)eng B，et al.Cardiac miR-133a overexpression prevents early cardiac fibrosis in diabetes［J］.J Cell Mol Med，2014，18(3):415-421.

［5］ He Y，Huang C，Lin X，et al，MicroRNA-29 family，a crucial therapeutic target for fibrosis diseases［J］.Biochimie，2013，95(7):1355-1359.

［6］ Morillo CA，Klein GJ，Jones DL，et al.Chronic rapid atrial pacing.Structural，functional，and electrophysiological characteristics of a new model of sustained atrial fibrillation［J］.Circulation，1995，91(5):1588-1595.

［7］ Wijffels MC，Kirchhof CJ，Dorland R，et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats［J］.Circulation，1995，92(7):1954-1968.

［8］ Yu WC，Lee SH，Tai CT，et al.Reversal of atrial electrical remodeling following cardioversion of long-standing atrial fibrillation in man［J］.Cardiovasc Res，1999，42(2):470-476.

［9］ Ausma J，van der Velden HM，Lenders MH，et al.Reverse structural and gap-junctional remodeling after prolonged atrial fibrillation in the goat［J］.Circulation，2003，107(15):2051-2058.

［10］ Brennecke J，Hipfner DR，Stark A，et al.Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila［J］.Cell，2003，113(1):25-36.

［11］Confirmation Z，Biliczki P，Bonauer A，et al.Changes in microRNA-1 expression and IK1 up-regulation in human atrial fibrillation［J］.Heart Rhythm，2009，6(12):1802-1809.

［12］Shan H，Zhang Y，Lu Y，et al.Downregulation of miR-133 and miR-590 contributes to nicotine-induced atrial remodelling in canines［J］.Cardiovasc Res，2009，83(3):465-472.

［13］ Roy S，Khanna S，Hussain SR，et al.MicroRNA expression in response to murine myocardial infarction:miR-21 regulates fibroblast metalloprotease-2 via phosphatase and tensin homologue［J］.Cardiovase Res，2009，82(1):21-29.

［14］ van Rooij E，Sutherland LB，Thatcher JE，et al.Dysregulation of microRNAs following myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(35):13027-13032.

［15］ Duisters RF，Tijsen AJ，Schroen B，et al.miR-133 and miR-30 regulate connective tissue growth factor:implications for a role of microRNAs in myocardial matrix remodeling［J］.Circ Res，2009，104(2):170-178.

［16］ Divakaran V，Adrogue J，Ishiyama M，et al.Adaptive and maladptive effects of SMAD3 signaling in the adult heart after hemodynamic pressure overloading［J］.Circ Heart Fail，2009，2(6):633-642.

［17］張 瑩，張 勇，蔡本志，等.microRNA在犬心房纖顫模型中的變化［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，41(2):92-94.