盧新林　岳玉霞　嚴(yán)泉祥　何原　陳文江　陳燦

【摘要】 目的：探討建立小鼠心肌梗死模型的快速簡(jiǎn)易方法，提高動(dòng)物存活率。方法：使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，在無(wú)創(chuàng)性機(jī)械通氣的條件下開胸，將心臟輕輕擠出胸腔后，用手術(shù)針鉤斷冠狀動(dòng)脈的左前降支（LAD），通過觀察存活率、心電圖改變和組織病理學(xué)染色來評(píng)價(jià)心肌梗死模型是否成功。同時(shí)與冠狀動(dòng)脈結(jié)扎組進(jìn)行比較。結(jié)果：LAD鉤斷術(shù)后心電圖出現(xiàn)ST段抬高，TTC染色可見明顯的梗死區(qū)域，術(shù)后4周心肌發(fā)生纖維化；模型組的術(shù)后存活率為85%，而冠狀動(dòng)脈結(jié)扎組則為54%。結(jié)論：應(yīng)用這種改良的新方法可以快速并成功地建立小鼠心肌梗死模型。

【關(guān)鍵詞】 心肌梗死； 戊巴比妥鈉； 機(jī)械通氣； 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎

冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化時(shí)可引起血管管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧和壞死即心肌梗死，甚至最終演變成為心衰[1-2]。在我國(guó)隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，冠心病的發(fā)病率死亡率都在逐年增長(zhǎng)，因此對(duì)冠心病的防治研究十分重要[3-4]。

在應(yīng)用動(dòng)物模型研究心肌梗死的致病機(jī)理以及使用藥物進(jìn)行干預(yù)時(shí)，都會(huì)涉及到心肌梗死模型的建立。以往報(bào)道的心肌梗死模型制作方法包括冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）結(jié)扎法、血栓形成法、藥物注射法、球囊堵塞法、Ameriod環(huán)套扎法和冷凍法，其中應(yīng)用得最為普遍的是LAD結(jié)扎法[5-13]。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇上，大鼠、兔、羊、豬和犬應(yīng)用得較多[14]。近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，小鼠已成為基因功能研究中不可取代的模式生物。然而小鼠體型較小，在應(yīng)用傳統(tǒng)的LAD結(jié)扎法制作心肌梗死模型時(shí)受到了極大的限制，而且存活率也比較低。

為了提高小鼠的心肌梗死術(shù)后存活率，并減少其在手術(shù)中承受的痛苦，極大程度地提高動(dòng)物福利，該項(xiàng)研究從麻醉方法、呼吸支持到手術(shù)方法進(jìn)行了一系列改良，成功地建立了一種全新的且極為簡(jiǎn)易的小鼠心肌梗死模型制作方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明（KM）小鼠，雄性，6～8周齡，體重25～30 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的屏障環(huán)境下進(jìn)行，使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2011-0112。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 主要試劑 戊巴比妥鈉和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）購(gòu)自Sigma公司，蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2.2 手術(shù)器具 一次性備皮刀、眼科鑷、眼科剪、蚊式血管鉗、三角縫合針、皮膚縫線，8-0帶線縫合針。

1.2.3 主要儀器 光學(xué)顯微鏡（Leica）、HX-300S小動(dòng)物呼吸機(jī)和BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麻醉實(shí)驗(yàn) 注射用無(wú)菌水溶解戊巴比妥鈉至2%濃度。將30只KM小鼠隨機(jī)分為五組，每組6只，分別按60、70、80、90、100 mg/kg體重的劑量注射戊巴比妥鈉，并計(jì)算起效時(shí)間、深麻時(shí)間、維持時(shí)間、和復(fù)蘇時(shí)間，同時(shí)觀察各組小鼠的并發(fā)癥與死亡率。起效時(shí)間為注射無(wú)巴比妥鈉至小鼠進(jìn)入麻醉誘導(dǎo)狀態(tài)的時(shí)間；深麻時(shí)間為麻醉藥起效至進(jìn)入深麻狀態(tài)的時(shí)間；維持時(shí)間是從進(jìn)入深麻狀態(tài)至小鼠前肢開始抖動(dòng)的時(shí)間；復(fù)蘇時(shí)間是從有復(fù)蘇反應(yīng)到完全恢復(fù)意識(shí)的時(shí)間。

1.3.2 無(wú)創(chuàng)性機(jī)械通氣法 待小鼠進(jìn)入深麻狀態(tài)后，用一個(gè)總?cè)莘e約為5 mL的自制呼吸面罩完全封住小鼠的頭部，呼吸面罩的另一端連接到小動(dòng)物呼吸機(jī)，將呼吸頻率、潮氣量和呼吸比分別調(diào)節(jié)為90次/min、18 mL和5：4。

1.3.3 手術(shù)方法 模型組采用醫(yī)用膠帶固定小鼠的四肢，并用無(wú)菌針頭和引導(dǎo)電極連接到生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄術(shù)前心電圖。將小鼠心前區(qū)備皮并用碘伏溶液消毒，沿著左腋前線和劍突之間的連線，在心尖搏動(dòng)最明顯的部位剪開皮膚約1.5 cm，先作荷包縫合，但不打結(jié)；用蚊式血管鉗逐層地分離肌肉，到達(dá)胸腔后用血管鉗平行于胸骨擴(kuò)開胸腔，同時(shí)用左手從右側(cè)胸腔往左輕推，心臟即可從血管鉗間脫出胸腔；以左心耳為標(biāo)志，在左心耳下緣約3 mm處進(jìn)針，深度約0.5 mm，進(jìn)針口與出針口間距約為1 mm，快速鉤斷LAD后，用棉簽稍微按壓止血，然后將心臟推回胸腔（圖1）；拉緊荷包縫合并打結(jié)，用碘伏消毒切口處，5 min后再次測(cè)心電圖，待小鼠呼吸平穩(wěn)后撤離呼吸機(jī)。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎組（n=90）則采用傳統(tǒng)方法用手術(shù)線在相同部位結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

1.3.4 心肌梗死面積計(jì)算 于手術(shù)后第7天，處死小鼠并取出心臟，快速冷凍后，沿縱軸將心臟切成厚度均勻的5份，按照“夾心TTC染色法”進(jìn)行染色[14-15]。用相機(jī)在一固定的高度對(duì)心臟切片拍照，用圖像分析軟件ImageJ（NIH，USA）分析梗死區(qū)域與正常區(qū)域的面積大小，梗死面積用梗死區(qū)域的面積之和與心肌總面積的百分比表示。

圖1 開胸和LAD鉤斷手術(shù)過程

1.3.5 HE染色 在術(shù)后4周，取小鼠的心臟，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。將包埋的心臟橫切成厚度為4 μm的切片，用HE染色試劑盒進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并照相。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麻醉效果觀察 60、70 mg/kg劑量組的小鼠均未進(jìn)入深麻狀態(tài)，80 mg/kg劑量組僅有2只進(jìn)入深麻狀態(tài)，90 mg/kg劑量組和100 mg/kg劑量組各有3只進(jìn)入深麻狀態(tài)，各組均無(wú)死亡。90、100 mg/kg劑量組各有1只在麻醉后出現(xiàn)哮喘。從低到高的各劑量組的平均起效時(shí)間分別為（116±31）s、（125±50）s、（98±46）s、（92±27）s、（115±62）s，但是各組無(wú)顯著差異（P>0.05）。90 mg/kg劑量組的深麻時(shí)間為（19±15）min，維持時(shí)間為（133±42）min，復(fù)蘇時(shí)間為（33±6）min；100 mg/kg劑量組的深麻時(shí)間為（7±2）min，維持時(shí)間為（199±11）min，復(fù)蘇時(shí)間為（36±5）min。endprint

2.2 心電圖改變和術(shù)后存活率 用LAD鉤斷法制作心肌梗死模型的操作方法極為簡(jiǎn)單，從開胸到胸腔閉合全過程僅耗時(shí)約3 min，術(shù)后5 min測(cè)ECG出現(xiàn)一過性ST段弓背向上抬高提示心肌缺血（圖2），術(shù)后存活率為85%。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎組術(shù)后5 min同樣會(huì)出現(xiàn)一過性ST段弓背向上抬高（圖2），但其存活率為54%。

2.3 心肌梗死面積和心肌纖維化 正常心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀脫氫酶可將無(wú)色的氧化型TTC還原成為紅色的甲臜，因此應(yīng)用TTC染色以區(qū)分壞死的心肌與正常心肌。術(shù)后1周的心臟TTC染色結(jié)果顯示蒼白色區(qū)域?yàn)樾募」Ｋ绤^(qū)域，而鮮紅色區(qū)域（深色）為正常心肌，模型組（冠狀動(dòng)脈鉤斷組）的心肌梗死面積為（20.3±1.9）%，冠狀動(dòng)脈結(jié)扎組為（20.9±2.1）%（圖3），兩組梗死面積無(wú)明顯差異（P>0.05）。在術(shù)后4周，兩組小鼠的左心室均可見明顯的纖維化（圖4），此由慢性缺血導(dǎo)致。

3 討論

應(yīng)用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法時(shí)可根據(jù)研究目的選擇結(jié)扎的冠狀動(dòng)脈分支，具有梗死范圍明確的優(yōu)點(diǎn)，該法已普遍應(yīng)用于心肌缺血及缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型中，是冠心病研究中必不可少的實(shí)驗(yàn)手段之一。而小鼠的體型小，生命力相對(duì)較弱，按照傳統(tǒng)的冠脈結(jié)扎法建立心肌梗死模型時(shí)不僅操作繁瑣而且死亡率高。該項(xiàng)研究將心肌梗死手術(shù)過程中所涉及到的麻醉方式、機(jī)械通氣和LAD結(jié)扎方法一一進(jìn)行了優(yōu)化與改進(jìn)，旨在減少動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)中承受的痛苦，并極大的提高存活率，節(jié)約研究成本。

當(dāng)胸廓打開后，胸腔內(nèi)的壓力瞬間由負(fù)壓變?yōu)檎龎?，此時(shí)，肺臟膨張受到限制，因此機(jī)械通氣是保障動(dòng)物正常呼吸的有效方法。然而，小鼠的氣管非常細(xì)小，氣管插管時(shí)極易損傷周圍的血管與神經(jīng)，在此過程中便有一部分小鼠死亡。Gao等[16]曾經(jīng)將異氟烷通過用動(dòng)物麻醉機(jī)供給小鼠持續(xù)吸入，起到了麻醉與呼吸支持同時(shí)進(jìn)行的效果，在冠脈結(jié)扎術(shù)后撤離麻醉機(jī)，小鼠可在2 min內(nèi)復(fù)蘇。目前市面上的小動(dòng)物麻醉劑價(jià)格昂貴，而且有文獻(xiàn)[17]報(bào)道氣體麻醉藥異氟烷有明顯的心血管系統(tǒng)副作用?？紤]到這些因素，筆者利用現(xiàn)有的研究條件對(duì)麻醉方法和通氣方式進(jìn)行了改進(jìn)。戊巴比妥鈉常用來對(duì)手術(shù)中的小鼠進(jìn)行全身麻醉，副作用較小，但小鼠對(duì)戊巴比妥鈉的反應(yīng)呈現(xiàn)較大的個(gè)體差異[18]。筆者在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)使用50 mg/kg體重的劑量難以使小鼠進(jìn)入深麻狀態(tài)，故采用梯度劑量的戊巴比妥鈉麻醉小鼠，結(jié)果顯示即便高劑量也僅使一半小鼠進(jìn)入深麻狀態(tài)，同時(shí)還出現(xiàn)了呼吸道分泌物增多的癥狀，因此最終選擇使用80 mg/kg體重的劑量，對(duì)于不能在進(jìn)入深麻狀態(tài)的小鼠，一次性追加原劑量的20%，直至其進(jìn)入深麻狀態(tài)后才進(jìn)行開胸手術(shù)。借鑒臨床上用于心肺復(fù)蘇的人工呼吸面罩，筆者自制了一個(gè)能將小鼠頭部完全封住的面罩，在側(cè)面鉆開一直徑約2 mm的孔，呼吸面罩用過輸液管和橡膠管連接到小動(dòng)物呼吸機(jī)。呼吸機(jī)的頻率調(diào)節(jié)為小鼠麻醉后自身的呼吸頻率較為合適，至于潮氣量則需根據(jù)小鼠胸廓的起伏程度和存活情況自行優(yōu)化，在以后的手術(shù)便可直接使用優(yōu)化得到的數(shù)值。

采用傳統(tǒng)的手術(shù)方法結(jié)扎冠脈時(shí)，需要開胸暴露出足夠大的手術(shù)視野，極易損傷血管和肺臟，由術(shù)中誤傷和并發(fā)癥引起的死亡常有發(fā)生。該項(xiàng)研究應(yīng)用擠壓法暴露心臟，使得手術(shù)切口小，出血量少，冠狀動(dòng)脈容易找到，且不易損傷肺，并相應(yīng)地也縮短了手術(shù)時(shí)間，提高了術(shù)后存活率。以下歸納筆者的手術(shù)經(jīng)驗(yàn)：（1）開胸的位置在小鼠左腋與劍突連線的中點(diǎn)，也可稍向下，偏高或太過低時(shí)小鼠心臟不易擠出，若切口位置適宜一般可輕易擠出心臟，擠壓過程中切忌用力擠壓，否則易造成小鼠死亡，不易擠出時(shí)應(yīng)觀察切口是否在上述部位，如果不在可以嘗試在上述位置重新開胸；（2）LAD鉤斷的部位和進(jìn)針深淺度對(duì)模型是否成功非常重要，位置過高易致大范圍心肌梗死而使小鼠快速死亡，位置過低時(shí)心肌梗死面積小，進(jìn)針過深易穿破心臟致大出血死亡，而進(jìn)針過淺則不足以致心肌梗死；（3）在術(shù)中及術(shù)后采取保暖措施對(duì)促進(jìn)小鼠復(fù)蘇也有一定作用。

該項(xiàng)研究通過心電圖檢測(cè)和組織病理學(xué)染色充分證實(shí)了經(jīng)過改進(jìn)的新方法可以成功地建立小鼠心肌梗死模型。由于被鉤斷的血管不能再恢復(fù)灌注，此法僅適合制作心肌缺血模型，而不能應(yīng)用到心肌缺血再灌注損傷的研究中，但本文的麻醉方法和無(wú)創(chuàng)性機(jī)械通氣值得研究者們借鑒與參考。

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（收稿日期：2014-04-30） （本文編輯：蔡元元）endprint

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（收稿日期：2014-04-30） （本文編輯：蔡元元）endprint