超高效液相色譜測(cè)定雞飼料中的5種類胡蘿卜素添加劑

摘要：研究并建立了雞飼料中角黃素、蝦青素等5種類胡蘿卜素的超高效液相色譜分析法。采用乙腈提取飼料樣品后，將提取液直接進(jìn)行進(jìn)樣分析。色譜柱為Waters BEH C18 （1.7 m，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm；流速0.25 mL/min。結(jié)果表明，5種類胡蘿卜素在 50～500 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.01～0.10 mg/kg，定量限為0.03～0.40 mg/kg，回收率80%～105%，精密度小于15%，說明超高效液相色譜分析法操作簡(jiǎn)便，適宜用于測(cè)定雞飼料中的類胡蘿卜素。

關(guān)鍵詞：類胡蘿卜素；飼料；超高效液相色譜

中圖分類號(hào)： O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0273-03

收稿日期：2013-12-04

基金項(xiàng)目：江蘇省“六大人才高峰”高層次人才項(xiàng)目（編號(hào)：NY-062）。

作者簡(jiǎn)介：曲斌（1979—），男，遼寧盤錦人，博士，獸醫(yī)師，研究方向?yàn)楂F藥殘留分析新技術(shù)與新方法。E-mail：qubin2000@hotmail.com。類胡蘿卜素（carotenoids）是一類聚異戊二烯類天然色素，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，其分子結(jié)構(gòu)中含有大量的共軛雙鍵，在分子鏈的末端具有線性或環(huán)狀基團(tuán)，末端基團(tuán)、含氧官能團(tuán)以及氫化作用的強(qiáng)弱不同產(chǎn)生了大量結(jié)構(gòu)不同的類胡蘿卜素，常見的有蝦青素（astaxanthin）、角黃素（canthaxanthin）、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛（β-apo-8′-carotenal）、β-隱黃素（β-cryptoxanthin）、β-胡蘿卜素（β-carotene）等[1]。類胡蘿卜素具有抑制多不飽和脂肪酸的氧化、改善視力、提高免疫力、促進(jìn)色素形成等重要的生物學(xué)功能，目前常被添加到禽類或水產(chǎn)動(dòng)物的飼料中來改善禽蛋產(chǎn)品或水產(chǎn)品的色澤，使其具有誘人的顏色，從而提高產(chǎn)品的商業(yè)價(jià)值。近年來，不法商家為了謀求經(jīng)濟(jì)利益超量使用類胡蘿卜素，使得某些產(chǎn)品中類胡蘿卜素添加過量，而科學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，過量食用類胡蘿卜素對(duì)人體具有一定的副作用，特別是其中的角黃素，因此，歐盟修正了角黃素的最大殘留限量值為15 mg/kg（除蛋雞外的家禽肝臟）、30 mg/kg（蛋雞蛋黃）[2]、8 mg/kg （產(chǎn)蛋母雞用飼料）[3]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第1126號(hào)公告僅規(guī)定允許角黃素、蝦青素、β-胡蘿卜素等在家禽或水產(chǎn)動(dòng)物中使用，但未明確提出飼料中的允許限量[4]。因此，從源頭控制產(chǎn)品質(zhì)量，建立飼料中類胡蘿卜素的分析測(cè)定方法具有重要意義。本研究采用高效液相色譜分析法測(cè)定三黃雞飼料中的類胡蘿卜素類色素添加劑，以期建立雞飼料中類胡蘿卜素的多種組分測(cè)定方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)儀器

超高效液相色譜儀（UPLC）：Waters Acquity 超高效液相色譜系統(tǒng)（含高壓二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、TUV紫外可見波長(zhǎng)檢測(cè)器、Empower2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；KS 501振蕩器，IKA公司；Sigma 3K30離心機(jī)，Sartorius公司。

1.2材料與試劑

對(duì)照品：蝦青素、角黃素、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、β-隱黃素、β-胡蘿卜素，Sigma公司、Dr. Ehrenstorfer公司；色譜純乙腈，F(xiàn)isher公司；色譜純甲酸，Tedia公司；分析純乙腈，南京化學(xué)試劑有限公司；化學(xué)純2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT），百靈威公司；純凈水；PTFE（30 mm×0.45 μm）針式過濾器，National Scientific公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1對(duì)照品溶液的配置取適量上述5種對(duì)照品，精確稱定后置于棕色容量瓶中，用含1%BHT的丙酮溶解并稀釋定容，得100 g/mL的對(duì)照品溶液，于-18 ℃避光保存。

1.3.2工作液的配置取適量對(duì)照品溶液，用乙腈稀釋，分別制得50、100、150、200、250、375、500 ng/mL的工作液。

1.3.3色譜條件色譜柱：Waters BEH C18柱，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：01%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫：0→5 min，90% B→90% B，5→6 min，90% B→95%B，6→13 min，95%B→95%B，13→135 min，95%B→100%B，13.5→40 min，100%B→100%B，40→40.5 min，100%B→90%B，40.5→45 min，90%B→90%B，流速0.25 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：450 nm。

1.3.4工作曲線按工作液濃度由小到大依次在UPLC進(jìn)樣分析，以色譜峰面積對(duì)濃度作圖，計(jì)算線性方程和回歸系數(shù)。

1.3.5樣品處理稱取5 g雞飼料樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL乙腈，高速振蕩30 min，5 ℃、10 000 r/min 離心5 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm PTFE微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中，UPLC分析測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1專屬性分析

5種類胡蘿卜素對(duì)照品溶液的色譜圖見圖1，空白飼料的色譜圖見圖2，飼料中陽性添加的色譜圖見圖3，某批次真實(shí)檢出的飼料樣品的色譜圖見圖4。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

5種類胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程見表1。endprint

摘要：研究并建立了雞飼料中角黃素、蝦青素等5種類胡蘿卜素的超高效液相色譜分析法。采用乙腈提取飼料樣品后，將提取液直接進(jìn)行進(jìn)樣分析。色譜柱為Waters BEH C18 （1.7 m，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm；流速0.25 mL/min。結(jié)果表明，5種類胡蘿卜素在 50～500 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.01～0.10 mg/kg，定量限為0.03～0.40 mg/kg，回收率80%～105%，精密度小于15%，說明超高效液相色譜分析法操作簡(jiǎn)便，適宜用于測(cè)定雞飼料中的類胡蘿卜素。

關(guān)鍵詞：類胡蘿卜素；飼料；超高效液相色譜

中圖分類號(hào)： O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0273-03

收稿日期：2013-12-04

基金項(xiàng)目：江蘇省“六大人才高峰”高層次人才項(xiàng)目（編號(hào)：NY-062）。

作者簡(jiǎn)介：曲斌（1979—），男，遼寧盤錦人，博士，獸醫(yī)師，研究方向?yàn)楂F藥殘留分析新技術(shù)與新方法。E-mail：qubin2000@hotmail.com。類胡蘿卜素（carotenoids）是一類聚異戊二烯類天然色素，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，其分子結(jié)構(gòu)中含有大量的共軛雙鍵，在分子鏈的末端具有線性或環(huán)狀基團(tuán)，末端基團(tuán)、含氧官能團(tuán)以及氫化作用的強(qiáng)弱不同產(chǎn)生了大量結(jié)構(gòu)不同的類胡蘿卜素，常見的有蝦青素（astaxanthin）、角黃素（canthaxanthin）、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛（β-apo-8′-carotenal）、β-隱黃素（β-cryptoxanthin）、β-胡蘿卜素（β-carotene）等[1]。類胡蘿卜素具有抑制多不飽和脂肪酸的氧化、改善視力、提高免疫力、促進(jìn)色素形成等重要的生物學(xué)功能，目前常被添加到禽類或水產(chǎn)動(dòng)物的飼料中來改善禽蛋產(chǎn)品或水產(chǎn)品的色澤，使其具有誘人的顏色，從而提高產(chǎn)品的商業(yè)價(jià)值。近年來，不法商家為了謀求經(jīng)濟(jì)利益超量使用類胡蘿卜素，使得某些產(chǎn)品中類胡蘿卜素添加過量，而科學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，過量食用類胡蘿卜素對(duì)人體具有一定的副作用，特別是其中的角黃素，因此，歐盟修正了角黃素的最大殘留限量值為15 mg/kg（除蛋雞外的家禽肝臟）、30 mg/kg（蛋雞蛋黃）[2]、8 mg/kg （產(chǎn)蛋母雞用飼料）[3]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第1126號(hào)公告僅規(guī)定允許角黃素、蝦青素、β-胡蘿卜素等在家禽或水產(chǎn)動(dòng)物中使用，但未明確提出飼料中的允許限量[4]。因此，從源頭控制產(chǎn)品質(zhì)量，建立飼料中類胡蘿卜素的分析測(cè)定方法具有重要意義。本研究采用高效液相色譜分析法測(cè)定三黃雞飼料中的類胡蘿卜素類色素添加劑，以期建立雞飼料中類胡蘿卜素的多種組分測(cè)定方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)儀器

超高效液相色譜儀（UPLC）：Waters Acquity 超高效液相色譜系統(tǒng)（含高壓二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、TUV紫外可見波長(zhǎng)檢測(cè)器、Empower2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；KS 501振蕩器，IKA公司；Sigma 3K30離心機(jī)，Sartorius公司。

1.2材料與試劑

對(duì)照品：蝦青素、角黃素、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、β-隱黃素、β-胡蘿卜素，Sigma公司、Dr. Ehrenstorfer公司；色譜純乙腈，F(xiàn)isher公司；色譜純甲酸，Tedia公司；分析純乙腈，南京化學(xué)試劑有限公司；化學(xué)純2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT），百靈威公司；純凈水；PTFE（30 mm×0.45 μm）針式過濾器，National Scientific公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1對(duì)照品溶液的配置取適量上述5種對(duì)照品，精確稱定后置于棕色容量瓶中，用含1%BHT的丙酮溶解并稀釋定容，得100 g/mL的對(duì)照品溶液，于-18 ℃避光保存。

1.3.2工作液的配置取適量對(duì)照品溶液，用乙腈稀釋，分別制得50、100、150、200、250、375、500 ng/mL的工作液。

1.3.3色譜條件色譜柱：Waters BEH C18柱，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：01%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫：0→5 min，90% B→90% B，5→6 min，90% B→95%B，6→13 min，95%B→95%B，13→135 min，95%B→100%B，13.5→40 min，100%B→100%B，40→40.5 min，100%B→90%B，40.5→45 min，90%B→90%B，流速0.25 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：450 nm。

1.3.4工作曲線按工作液濃度由小到大依次在UPLC進(jìn)樣分析，以色譜峰面積對(duì)濃度作圖，計(jì)算線性方程和回歸系數(shù)。

1.3.5樣品處理稱取5 g雞飼料樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL乙腈，高速振蕩30 min，5 ℃、10 000 r/min 離心5 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm PTFE微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中，UPLC分析測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1專屬性分析

5種類胡蘿卜素對(duì)照品溶液的色譜圖見圖1，空白飼料的色譜圖見圖2，飼料中陽性添加的色譜圖見圖3，某批次真實(shí)檢出的飼料樣品的色譜圖見圖4。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

5種類胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程見表1。endprint

摘要：研究并建立了雞飼料中角黃素、蝦青素等5種類胡蘿卜素的超高效液相色譜分析法。采用乙腈提取飼料樣品后，將提取液直接進(jìn)行進(jìn)樣分析。色譜柱為Waters BEH C18 （1.7 m，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm；流速0.25 mL/min。結(jié)果表明，5種類胡蘿卜素在 50～500 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.01～0.10 mg/kg，定量限為0.03～0.40 mg/kg，回收率80%～105%，精密度小于15%，說明超高效液相色譜分析法操作簡(jiǎn)便，適宜用于測(cè)定雞飼料中的類胡蘿卜素。

關(guān)鍵詞：類胡蘿卜素；飼料；超高效液相色譜

中圖分類號(hào)： O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0273-03

收稿日期：2013-12-04

基金項(xiàng)目：江蘇省“六大人才高峰”高層次人才項(xiàng)目（編號(hào)：NY-062）。

作者簡(jiǎn)介：曲斌（1979—），男，遼寧盤錦人，博士，獸醫(yī)師，研究方向?yàn)楂F藥殘留分析新技術(shù)與新方法。E-mail：qubin2000@hotmail.com。類胡蘿卜素（carotenoids）是一類聚異戊二烯類天然色素，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，其分子結(jié)構(gòu)中含有大量的共軛雙鍵，在分子鏈的末端具有線性或環(huán)狀基團(tuán)，末端基團(tuán)、含氧官能團(tuán)以及氫化作用的強(qiáng)弱不同產(chǎn)生了大量結(jié)構(gòu)不同的類胡蘿卜素，常見的有蝦青素（astaxanthin）、角黃素（canthaxanthin）、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛（β-apo-8′-carotenal）、β-隱黃素（β-cryptoxanthin）、β-胡蘿卜素（β-carotene）等[1]。類胡蘿卜素具有抑制多不飽和脂肪酸的氧化、改善視力、提高免疫力、促進(jìn)色素形成等重要的生物學(xué)功能，目前常被添加到禽類或水產(chǎn)動(dòng)物的飼料中來改善禽蛋產(chǎn)品或水產(chǎn)品的色澤，使其具有誘人的顏色，從而提高產(chǎn)品的商業(yè)價(jià)值。近年來，不法商家為了謀求經(jīng)濟(jì)利益超量使用類胡蘿卜素，使得某些產(chǎn)品中類胡蘿卜素添加過量，而科學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，過量食用類胡蘿卜素對(duì)人體具有一定的副作用，特別是其中的角黃素，因此，歐盟修正了角黃素的最大殘留限量值為15 mg/kg（除蛋雞外的家禽肝臟）、30 mg/kg（蛋雞蛋黃）[2]、8 mg/kg （產(chǎn)蛋母雞用飼料）[3]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第1126號(hào)公告僅規(guī)定允許角黃素、蝦青素、β-胡蘿卜素等在家禽或水產(chǎn)動(dòng)物中使用，但未明確提出飼料中的允許限量[4]。因此，從源頭控制產(chǎn)品質(zhì)量，建立飼料中類胡蘿卜素的分析測(cè)定方法具有重要意義。本研究采用高效液相色譜分析法測(cè)定三黃雞飼料中的類胡蘿卜素類色素添加劑，以期建立雞飼料中類胡蘿卜素的多種組分測(cè)定方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)儀器

超高效液相色譜儀（UPLC）：Waters Acquity 超高效液相色譜系統(tǒng)（含高壓二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、TUV紫外可見波長(zhǎng)檢測(cè)器、Empower2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；KS 501振蕩器，IKA公司；Sigma 3K30離心機(jī)，Sartorius公司。

1.2材料與試劑

對(duì)照品：蝦青素、角黃素、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、β-隱黃素、β-胡蘿卜素，Sigma公司、Dr. Ehrenstorfer公司；色譜純乙腈，F(xiàn)isher公司；色譜純甲酸，Tedia公司；分析純乙腈，南京化學(xué)試劑有限公司；化學(xué)純2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT），百靈威公司；純凈水；PTFE（30 mm×0.45 μm）針式過濾器，National Scientific公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1對(duì)照品溶液的配置取適量上述5種對(duì)照品，精確稱定后置于棕色容量瓶中，用含1%BHT的丙酮溶解并稀釋定容，得100 g/mL的對(duì)照品溶液，于-18 ℃避光保存。

1.3.2工作液的配置取適量對(duì)照品溶液，用乙腈稀釋，分別制得50、100、150、200、250、375、500 ng/mL的工作液。

1.3.3色譜條件色譜柱：Waters BEH C18柱，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：01%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫：0→5 min，90% B→90% B，5→6 min，90% B→95%B，6→13 min，95%B→95%B，13→135 min，95%B→100%B，13.5→40 min，100%B→100%B，40→40.5 min，100%B→90%B，40.5→45 min，90%B→90%B，流速0.25 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：450 nm。

1.3.4工作曲線按工作液濃度由小到大依次在UPLC進(jìn)樣分析，以色譜峰面積對(duì)濃度作圖，計(jì)算線性方程和回歸系數(shù)。

1.3.5樣品處理稱取5 g雞飼料樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL乙腈，高速振蕩30 min，5 ℃、10 000 r/min 離心5 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm PTFE微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中，UPLC分析測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1專屬性分析

5種類胡蘿卜素對(duì)照品溶液的色譜圖見圖1，空白飼料的色譜圖見圖2，飼料中陽性添加的色譜圖見圖3，某批次真實(shí)檢出的飼料樣品的色譜圖見圖4。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

5種類胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程見表1。endprint