田 輝，于凱忠，毛爭春，金成華，潘海彬，楊 曦，黃曉燕，沈韋羽*

(1寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院胸外科，寧波 315041;2寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院中心實驗室;*通訊作者，E-mail:nblhlswy@163.com)

近年來肺癌的發(fā)病率和死亡率迅速上升，躍居腫瘤第一位，其治療也成為人們關(guān)注的焦點。其中以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)為靶點的靶向治療方法以其較好的特異性和較小的副作用逐漸被腫瘤學(xué)術(shù)界和廣大患者所重視。

EGFR是一種受體型酪氨酸激酶，在許多腫瘤中過表達和/或發(fā)生突變，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)控制腫瘤生長，并與新生血管生成、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等有密切的關(guān)系［1］。以EGFR為靶點的EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)的藥物(如厄羅替尼和吉非替尼)在非小細胞肺癌，特別是在肺腺癌的治療中顯示出很好的抗腫瘤的療效，但并非所有使用該藥的肺癌患者都能受益［2］。近期的研究發(fā)現(xiàn)EGFR的基因的19和21外顯子的突變與TKIs的療效密切相關(guān)，不同外顯子的突變將導(dǎo)致蛋白的構(gòu)象變化，改變和增強蛋白的活性，增強對TKIs的敏感性［3］。本研究檢測了314例中國大陸非小細胞肺癌患者的EGFR突變情況，并與部分國外報道的數(shù)據(jù)進行比較，同時分析EGFR突變與其臨床特征間的關(guān)系，旨在為篩選最合適的病人進行有針對性的靶向治療提供依據(jù)，避免不合理用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

收集寧波李惠利醫(yī)院2012－06～2013－11間胸外科手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的非小細胞肺癌標本314例，其中男性199例，女性115例;年齡34－82歲，中位數(shù)61歲;有吸煙史的病人191例;根據(jù)ICC 1997年新的修訂標準進行TNM分期，Ⅰ期89例，Ⅱ期87例，Ⅲ期116例，Ⅳ期22例;所有患者術(shù)前均未接受過放化療和EGFR－TKI治療等抗腫瘤治療。所有標本均用裝有RNAlater(QIAGEN Catalog no.76106)的凍存管保存于4℃，并于2 d內(nèi)送到實驗室進行檢測。

1.2 方法

采用PCR擴增和測序法分析肺癌患者手術(shù)組織中EGFR外顯子19，21突變情況。手術(shù)組織DNA提取采用PROMEGA Wizard?基因組DNA純化試劑盒并按說明書步驟進行。取15 ml離心管一只，加入600μl核裂解液，10－20 mg組織，使用小型勻漿機勻漿10 s。65℃孵育該裂解物15－30 min。待樣品達到室溫后，加入200μl蛋白沉淀液并使用渦旋振蕩器高速劇烈振蕩20 s。置于冰上冷卻5 min。(13 000－16 000)×g離心4 min，可形成白色致密的蛋白沉淀。在一個干凈的1.5 ml小離心管中，加入600μl室溫異丙醇。移取上步中含DNA的上清至此小離心管。輕輕顛倒混勻溶液，直至白色線狀DNA形成塊狀沉淀。(13 000－16 000)×g室溫離心1 min?？梢姲咨K狀DNA沉淀。小心棄去上清。加入600μl室溫70%乙醇，輕輕顛倒離心管數(shù)次清洗DNA沉淀，(13 000－16 000)×g室溫離心1 min。使用加樣槍頭小心吸走乙醇溶液。將離心管倒置在干凈的吸水紙上，自然干燥10－15 min。向離心管中加入100μl DNA Rehydration Solution，65℃孵育30 min溶解DNA。取2μl測定濃度和純度，其余儲存于－80℃。通過PCR方法擴增EGFR基因外顯子19和21，exon19引物序列分別為上游:5’－GCAATATCAGCCTTAGG－3’，下游:5’－TCCAGACATGAGAAAAGG－3’;exon21上游:5’－TTCTTTGGATCAGTAGTCAC－3’，下游 5’－CATGTGTTAAACAATACAGC－3’。具體操作方法參照試劑盒(PROMEGA GoTaq? GreenMaster Mix)說明進行。最后在ABI3730測序儀上機測序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件對率的數(shù)據(jù)進行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變特點

在314例肺癌標本中，共檢測到EGFR基因突變120例(38.2%)。其中外顯子19檢測到EGFR基因突變51例(42.5%);外顯子21檢測到EGFR基因突變69例(57.5%);未見外顯子19和外顯子21的雙突變。其中，外顯子19的突變以del E746－A750型為主，有35例(29.1%)，而del L747－A750型突變有11例(9.1%)，其他突變類型5例;在本組病例中，69例外顯子21的L858R型突變有65例(54.1%)，L861Q 型的突變有4 例(3.3%，見表1)。

2.2 EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系

在這314例病例中，男性患者的EGFR突變率為21.1%(42/199)，明顯低于女性患者(67.8%，78/115，P＜0.05)。無吸煙史者EGFR基因突變發(fā)生率為 58.5%(72/123)，有吸煙史者為 25.1%(48/191)，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表2)。TNM分期Ⅰ期EGFR基因突變發(fā)生率為39.2%，Ⅱ期為 35.6%，Ⅲ期為 38.8%，Ⅳ期為40.9%，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 EGFR基因突變特點Table 1 Distribution of EGFR gene mutation

表2 EGFR基因突變與臨床特征關(guān)系 例(%)Table 2 Correlation between EGFR gene mutation and clinical features cases(%)

3 討論

Lynch 等［3］和 Paez等［4］報道了酪氨酸激酶抑制劑EGFR－TKI對非小細胞肺癌的療效與EGFR外顯子的突變明顯相關(guān)。EGFR基因共28個外顯子，其中編碼酪氨酸激酶區(qū)的是第18－21外顯子。對EGFR基因突變的數(shù)據(jù)分析表明，盡管突變部位分散在整個酪氨酸激酶編碼區(qū)，但89%的突變集中在第19外顯子的缺失和第21外顯子的L858R點突變［5］，且突變多發(fā)生于于腺癌、非吸煙和女性肺癌患者［6］。美國非小細胞肺癌的患者中只有約10%有EGFR的基因突變，但是在亞洲人中，約30%的非小細胞肺癌患者有EGFR的基因突變［7，8］。本研究發(fā)現(xiàn)，在中國的 NSCLC 患者中，38.2%(120/314)的患者存在EGFR外顯子19或/和21的突變，EGFR的突變狀態(tài)與患者的性別、吸煙狀況有關(guān);女性、非吸煙者中EGFR外顯子19、21的突變率顯著高于其他患者，是選用TKIs治療的優(yōu)勢人群，這與國外文獻報道相符［3］。

以往的研究［3，4］表明，EGFR 外顯子 21 的L858R和外顯子19的缺失突變占突變的絕大多數(shù)，被認為是活化性突變。外顯子21的L858R單核苷酸的替換突變靠近保守的Asp-Phe-Gly序列，突變使活化頸環(huán)(activation-loop)的穩(wěn)定性增加。而外顯子19的缺失突變靠近alpha-C-helix(羧基端α螺旋結(jié)構(gòu)域)，而后者控制著與ATP結(jié)合囊的角度，突變使ATP 結(jié)合囊變窄［9］。Lynch 等［3］認為這兩種突變增強了EGFR與ATP或其競爭性抑制劑吉非替尼的相互作用。因此，有EGFR基因突變的患者表現(xiàn)出對吉非替尼更好的治療反應(yīng)。Mitsudomi等［10］注意到兩種突變在使用TKIs后的反應(yīng)有差異:在使用厄洛替尼或吉非替尼后，EGFR外顯子19缺失突變的患者有效率高于具有L858R突變的患者，且生存時間較L858R突變患者長。

綜上所述，由于NSCLC中EGFR基因突變與TKIs治療敏感性顯著相關(guān)，因此在肺癌的個體化治療中應(yīng)檢測EGFR基因的突變，并根據(jù)EGFR突變情況來選擇用藥，以避免患者因使用無效的藥物而承擔高額的醫(yī)療費用和耽誤治療時間。

［1］Sibilia M，Kroismayr R，Lichtenberger BM，etal.The epidermal growth factor receptor:from development to tumorigenesis［J］.Differentiation，2007，75(9):770－787.

［2］Kris MG，Natale RB，Herbst RS，etal.Efficacy of gefitinib，an inhibitor of the epidermal growth factor receptortyrosine kinase，in symptomatic patients with non-small cell lung cancer:a randomized trial［J］.JAMA，2003，290(16):2149－2158.

［3］Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，etal.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib［J］.N Engl JMed，2004，350(21):2129－2139.

［4］Paez JG，Janne PA，Lee JC，etal.EGFR mutations in lung cancer:correlation with clinical response to gefitinib therapy［J］.Science，2004，304(5676):1497－1500.

［5］Chan SK，Gullick WJ，Hill ME.Mutations of the epidermal growth factor receptor in Non-small-cell lung cancer search and destroy［J］.Eur JCancer，2006，42(1):17－23.

［6］Pao W ，Miler V，Zakowski M，etal.EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from‘never smokers’and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(36):13306－13311.

［7］Mitsudomi T，Kosaka T，Yatabe Y.Biological and clinical implications of EGFR mutations in lung cancer［J］.Inl JClin Oncol，2006，11(3):190－198.

［8］Sequist LV，Bell DW，Lynch TJ，etal.Molecular predictors of response to epidermal growth factor receptor antagonists in nonsmall-cell lung cancer［J］.J Clin Oncol，2007，25(5):587－595.

［9］Shigematsu H，Gazdar AF.Somatic mutations of epidermal growth factor receptor signaling pathway in lung cancers［J］.Int J Cancer，2006，118(2):257－262.

［10］Mitsudomi T，Kosaka T，Endoh H，etal.Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence［J］.J Clin Oncol，2005，23(11):2513－2520.