柳興源，孟海

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科，遼寧 錦州 121000)

有研究顯示，胃癌的發(fā)生同幽門(mén)螺桿菌(HP)的感染在流行病學(xué)上有諸多的相關(guān)性［1］。但HP 感染在胃癌發(fā)生中的確切機(jī)制尚不清楚。本研究采用組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)等方法，探討HP 感染后胃組織癌變發(fā)生的可能的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 臨床資料與方法

1.1 研究對(duì)象

以遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2010—2013 年間113 例手術(shù)胃癌切除標(biāo)本為研究對(duì)象進(jìn)行臨床病理學(xué)研究，并從本醫(yī)院2006—2010 年病理檔案中隨機(jī)抽取HP 相關(guān)性胃炎活檢標(biāo)本57 例作正常對(duì)照。所有研究對(duì)象標(biāo)本均由本醫(yī)院主治醫(yī)師以上人員采用雙盲法進(jìn)行HE 染色切片復(fù)讀確認(rèn)。全部標(biāo)本均經(jīng)過(guò)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，作3 μm 厚連續(xù)切片，以備本研究所用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 改良Giemsa 染色 (1)石蠟切片裝入染色架，70 ℃烤片8～10 min;(2)二甲苯中脫蠟3～6 min，重復(fù)2 次;(3)依次通過(guò)100%，95%，90%，80%，70%乙醇溶液各5 min，入自來(lái)水，沖洗約5 min，至切片清晰;(4)直接入3%Giemsa 染液中染色25～30 min;(5)自來(lái)水洗去染液;(6)直接入100%乙醇中脫水;(7)常規(guī)脫水、透明、封片;(8)室溫觀察。

參與本實(shí)驗(yàn)共113 例胃癌組織，應(yīng)用組織學(xué)改良Giemsa 染色檢測(cè)HP 感染，試劑變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性，不變色者為陰性。57 例慢性胃炎組織，應(yīng)用組織學(xué)改良Giemsa 染色檢測(cè)HP 感染，試劑變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性，不變色者為陰性。根據(jù)文獻(xiàn)，HP 陽(yáng)性的判定方法為:改良Giemsa 染色是陽(yáng)性者為HP 感染陽(yáng)性，是陰性者判定為HP 感染陰性。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

一抗分別為鼠抗人TGF-β1 和NF-κB，稀釋度均為1∶100。組織切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸熱抗原修復(fù)，SP 法操作，DAB 顯色。用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片的顯色反應(yīng)，選擇5 個(gè)以上的高倍鏡視野(×200)不少于1 000 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照，用己知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。

免疫組化結(jié)果判定方法:TGF-β1 蛋白在胃癌組織中主要分布于細(xì)胞漿及細(xì)胞核［2］，呈棕灰黃色顆粒狀，按照細(xì)胞的染色比例分級(jí)方法進(jìn)行結(jié)果判斷，以細(xì)胞核染色為陽(yáng)性計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。細(xì)胞漿染色忽略，核染色＞50% (+++)，核染色(++)，核染色＜10% (+)，未著色(-)，認(rèn)定前2 個(gè)等級(jí)為陰性表達(dá)，后2 個(gè)等級(jí)為陽(yáng)性表達(dá)。

NF-κB 蛋白在胃癌組織中除主要表達(dá)在胞漿外，尚可見(jiàn)部分胞核轉(zhuǎn)位。染色程度評(píng)分可按如下標(biāo)準(zhǔn):著色深為2 分，著色淡為1 分，基本不著色為0 分。染色細(xì)胞百分率評(píng)分可按如下標(biāo)準(zhǔn):著色細(xì)胞數(shù)比視野中計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)的百分率，76%～100%為4 分，51%～75%為3 分，26%～50%為2分，6%～25%為1 分，0～5%為0 分，將每張切片染色程度得分與染色細(xì)胞百分率得分相加的和為最后得分，＞7 分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，5～6 分為中等陽(yáng)性(++)，3～4 分為弱陽(yáng)性(+)，0～2分為(-)認(rèn)定后1 個(gè)等級(jí)為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果分析采用t 檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)和精確概率法。

2 結(jié) 果

2.1 HP 的檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在胃癌組中HP 陽(yáng)性者88 例，HP陰性者25 例，感染率為77.9%。在慢性胃炎組中HP 陽(yáng)性者29 例，HP 陰性者28 例。感染率為50.9%。胃癌組織中的HP 感染率明顯高于慢性胃炎組，(χ2=12.87，P ＜0.01，見(jiàn)表1)。

表1 胃癌組織和慢性胃炎組織的HP 感染情況比較

2.2 HP 感染與胃癌組織臨床病理特征之間的關(guān)系

由表3 可見(jiàn)，胃癌患者的腫瘤部位、大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與HP 感染無(wú)相關(guān)性(P ＞0.05)，而與胃癌組織浸潤(rùn)深度有關(guān)。浸潤(rùn)至肌層的胃癌組織HP 感染率為71.0%，浸潤(rùn)至漿膜面的胃癌組織HP 感染率為88.6%，浸潤(rùn)至肌層的胃癌組織HP 感染率明顯低于浸潤(rùn)至漿膜面的胃癌組織HP 感染率，(χ2=4.84，P ＜0.05)。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 TGF-β1 蛋白在HP (+)和HP (-)胃癌組織中表達(dá) TGF-β1 蛋白在胃癌組織中主要分布于細(xì)胞漿及細(xì)胞核，呈棕灰黃色顆粒狀，按照細(xì)胞的染色比例分級(jí)方法進(jìn)行結(jié)果判斷，以細(xì)胞核染色為陽(yáng)性計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明TGF-β1 蛋白在HP+和HP-胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.1%和52.0%，(χ2=5.49，P ＜0.05，見(jiàn)表4)。

2.3.2 NF-κB 蛋白在HP (+)和HP (-)胃癌組織中表達(dá) NF-κB 蛋白在胃癌組織中除主要表達(dá)在胞漿外，尚可見(jiàn)部分胞核轉(zhuǎn)位。根據(jù)染色程度評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明NF-κB 蛋白在HP(+)和HP (-)胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.5%和40.0%，(χ2=4.03，P ＜0.05，見(jiàn)表5)。

表2 HP 感染與胃癌組織臨床病理特征之間的關(guān)系

表3 TGF-β1 蛋白在胃癌組織HP (+)組和HP (-)組的陽(yáng)性表達(dá)情況

表4 NF-κB 蛋白在胃癌組織HP (+)組和HP (-)組的陽(yáng)性表達(dá)情況

3 討 論

胃癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，目前我國(guó)胃癌患者數(shù)量呈持續(xù)增加趨勢(shì)［3］。HP 感染是胃癌發(fā)生的主要誘發(fā)條件，被認(rèn)為是癌變的前體狀態(tài)。在本研究中胃癌組中HP 陽(yáng)性者88 例，HP 陰性者25 例，感染率為77.9%;在慢性胃炎組中HP 陽(yáng)性者29 例，HP 陰性者28 例，感染率為50.9%。胃癌組織中的HP 感染率明顯高于慢性胃炎組。(χ2=12.87，P ＜0.01)這個(gè)結(jié)果顯示，在HP 在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到了重要作用。

本研究針對(duì)HP 感染與胃癌患者性別、年齡、腫瘤部位、大小、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及胃癌組織浸潤(rùn)深度的相關(guān)性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者的腫瘤部位、大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與HP 感染無(wú)相關(guān)性(P ＞0.05)，而與胃癌組織浸潤(rùn)深度有關(guān)。浸潤(rùn)至肌層的胃癌組織HP 感染率明顯低于浸潤(rùn)至漿膜面的胃癌組織HP 感染率。(χ2=4.84，P ＜0.05)這個(gè)結(jié)果可能與HP 本身的性質(zhì)有關(guān)。HP是一種革蘭陰性微需氧菌，一般定植在胃上皮細(xì)胞表面，具有良好的動(dòng)力及粘附功能。HP 菌株可引起慢性胃炎、萎縮性胃炎、腸上皮化生、胃粘膜糜爛及胃潰瘍，長(zhǎng)期感染浸潤(rùn)較深者胃癌發(fā)生率較高。來(lái)自人體的主要阻止腫瘤浸潤(rùn)、惡化和轉(zhuǎn)移的壁壘是基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，降解ECM和基底膜的能力是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移首要條件［4］。HP 感染后分泌多種酶類(lèi)降解ECM 和基底膜的膠原，促使細(xì)胞侵襲相鄰結(jié)締組織進(jìn)入血管和淋巴管，最后繼發(fā)組織器官擴(kuò)展性生長(zhǎng)。

TGF 是一類(lèi)具有轉(zhuǎn)化作用的多肽類(lèi)生長(zhǎng)因子超家族，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，分化，形態(tài)形成及刺激ECM 分泌，抑制免疫反應(yīng)［5］。TGF-β 使腫瘤細(xì)胞免疫逃避，腫瘤細(xì)胞增殖加快。TGF-βl 是TGF-β 家族的主要成員之一，是調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育分化等功能的主要因子。近年來(lái)有學(xué)者報(bào)道，TGF-βl 與胃癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。在多種惡性腫瘤中呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)，TGF-βl 的過(guò)度表達(dá)在腫瘤浸潤(rùn)、惡化和轉(zhuǎn)移中起到重要的作用并與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)［6］。對(duì)正常細(xì)胞，TGF-βl 可看作一種抑癌因子，通過(guò)其信號(hào)通路使細(xì)胞停止在Gl 期抑制細(xì)胞增殖。但當(dāng)細(xì)胞惡變時(shí)，TGF-βl 信號(hào)通路發(fā)生改變，TGF-βRl (TGF-βl 受體)發(fā)生改變，下游smdas 蛋白表達(dá)發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)TGF-βl 不敏感。在腫瘤的早期階段，TGF-βl 對(duì)腫瘤的早期發(fā)展有抑制作用;在腫瘤的發(fā)展階段，TGF-βl 的抑制增殖作用消失，細(xì)胞出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng);在腫瘤的晚期階段，TGF-βl 對(duì)腫瘤的晚期發(fā)展有促進(jìn)作用，通過(guò)細(xì)胞播散、刺激血管生成、免疫抑制、合成ECM等途徑，提供適宜于腫瘤生長(zhǎng)浸潤(rùn)、惡化和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞環(huán)境［7］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，結(jié)果表明TGF-β1 蛋白在HP (+)和HP (-)胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.1% 和52.0% (χ2=5.49，P ＜0.05)。HP 感染后，TGF-β1 對(duì)腫瘤的發(fā)展有促進(jìn)作用。另外還有學(xué)者認(rèn)為胃癌細(xì)胞產(chǎn)生的TGFβ 能刺激成纖維母細(xì)胞增殖，而使胃壁僵硬，形成所謂的“皮革胃”［8］。

近年研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的調(diào)節(jié)紊亂是許多腫瘤的發(fā)生的重要原因，在癌癥組織中NF-κB 的過(guò)表達(dá)可能是腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生凋亡作用的主要途徑［9］。當(dāng)NF-κB 通道激活后，可以產(chǎn)生較強(qiáng)的抗凋亡信號(hào)因子，從而產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤的發(fā)展的作用。本研究結(jié)果表明NF-κB 蛋白在HP +和HP-胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.5%和40.0%。(χ2=4.03，P ＜0.05)HP 感染后，胃粘膜形成胃炎后可通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活NF-κB，NF-κB 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄及信號(hào)傳導(dǎo)等功能，可進(jìn)一步激活其下游靶基因促進(jìn)胃癌的形成。已有許多研究示，HP 的感染與NF-κB 蛋白的高表達(dá)有密切的關(guān)聯(lián)［10］。

本研究提示HP 感染后可能通過(guò)TGF-β 及NF-κB 兩條通路調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄及信號(hào)傳導(dǎo)在胃癌的浸潤(rùn)、惡化和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用。TGF-β 及NF-κB 通路可能成為判斷胃癌的重要指標(biāo)。檢測(cè)TGF-β 及NF-κB 聯(lián)合表達(dá)可以更進(jìn)一步的了解腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)行為從而解釋腫瘤浸潤(rùn)、惡化和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。同時(shí)也提供了一個(gè)新的胃癌靶點(diǎn)，為研究新的抗腫瘤藥物奠定了理論基礎(chǔ)。

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