A1AR在低鹽刺激小鼠腎素分泌中的可能作用

郝錦玲，劉 琳，蔣蘭萍，施瀟瀟，文煜冰，李榮山，陳麗萌*

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)院 腎內科，北京 100730； 2.山西醫(yī)科大學 第二醫(yī)院 腎內科，山西 太原 030000)

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研究論文

A1AR在低鹽刺激小鼠腎素分泌中的可能作用

郝錦玲1,2 #，劉 琳1#，蔣蘭萍1，施瀟瀟1，文煜冰1，李榮山2，陳麗萌1*

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)院 腎內科，北京 100730； 2.山西醫(yī)科大學 第二醫(yī)院 腎內科，山西 太原 030000)

目的觀察腺苷A1型受體(A1AR)基因敲除小鼠的病理生理特點及A1AR在慢性低鹽刺激腎素分泌中的作用。方法C57BL/6J品系A1AR基因敲除雜合子(A1AR+/-)小鼠，經繁殖及基因鑒定后，雜合子子代小鼠用于擴大繁殖，A1AR+/+小鼠(n=13)及A1AR-/-小鼠(n=14)用于實驗。觀察兩組小鼠生長發(fā)育、基本生理情況(血壓、心率、腎功能和血尿電解質)、腎臟病理和免疫組化觀察腎臟局部腎素表達和檢測血漿醛固酮水平(A1AR+/+組n=5，A1AR-/-組n=5)。結果低鹽飲食后，A1AR-/-小鼠腎皮質腎素表達明顯增加(Plt;0.05)，全身醛固酮水平和24 h尿鉀排泄量顯著高于A1AR+/+小鼠(Plt;0.05)。結論A1AR可能參與了低鹽刺激小鼠腎素分泌的過程。

低鹽飲食；A1AR；腎素

腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system, RAS)是機體調節(jié)水鹽平衡和血壓最重要的激素，其中腎素作為第1個限速酶起到關鍵作用，90%的腎素由腎臟腎小球旁器 (juxtaglomerular apparatus, JGA)

顆粒細胞分泌。低鹽是調節(jié)腎素分泌的三大經典機制之一，它主要通過腎臟腎小球旁器致密斑途徑刺激腎素分泌。低鹽還降低致密斑分泌ATP代謝的最終產物腺苷(adenosine，A),減少腎小球入球動脈其A1型腺苷受體(A1 adenosine receptor，A1AR)的活化，舒張入球動脈，通過管球反饋(tubuloglomerular feedback, TGF)調節(jié)水鹽平衡[1-2]。然而腺苷及其受體通過TGF和腎素旁分泌兩大途徑調節(jié)血壓的機制尚不清楚，國內因為缺乏研究平臺，鮮有相關的研究，本研究引進A1AR-/-小鼠，觀察低鹽飲食下，該基因敲除小鼠的病理生理特點及A1AR在慢性低鹽刺激腎素分泌中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 A1AR基因敲除動物的引進與育種

C57BL/6J品系A1AR基因敲除雜合子(A1AR+/-)小鼠經繁殖及鑒定后的子代小鼠用于擴大繁殖及實驗。根據《中華人民共和國進出境動植物檢疫法》及《進出境動物臨時隔離檢疫場管理辦法》要求，對引進小鼠進行為期30d的隔離檢疫，檢疫結果合格，微生物控制級別符合中國SPF級小鼠要求。按照SPF級實驗動物操作規(guī)程將小鼠置于動物房獨立送風隔離籠具內，室內溫度18～22 ℃，濕度50%左右，日光照明。采用1只雄性A1AR+/-小鼠與2只雌性A1AR+/-小鼠同居的方式進行繁殖。記錄種鼠產仔率，在仔鼠7～14 d 齡期間對其進行剪指法編號，同時留取剪掉的指端標本用于基因鑒定。

1.2 A1AR基因敲除小鼠的基因鑒定

表1 用于基因鑒定的A1AR和NeoR基因引物序列Table 1 Primer sequence of A1AR and NeoR for genotyping

圖1 小鼠DNA鑒定部分結果Fig 1 Results of partial DNA identification

1.3 動物飼養(yǎng)和分組

A1AR+/+小鼠(n=13)和A1AR-/-小鼠(n=14)小鼠置于北京協(xié)和醫(yī)院SPF級實驗動物中心，飼養(yǎng)條件同前，飼料由北京科奧協(xié)利飼料有限公司提供，正常鹽飼料(含NaCl 0.3%，K 0.6%)飼養(yǎng)4周后更換為低鹽飲食(含NaCl 0.03%, K 0.6%)。實驗第8周處死小鼠。

1.4 血清生化和血漿醛固酮水平的檢測

使用內眥靜脈叢采血法取得全血，靜置2 h后以室溫8 000r/min離心10 min，使用全自動生化儀器檢測肌酐、尿素氮、尿酸、鈉、鉀、氯、血糖及三酰甘油等生化指標，其中常規(guī)用酶法檢測血肌酐，脲酶法檢測血尿素氮，尿酸酶法檢測血尿酸。部分肝素抗凝血，分離血漿后，放射性免疫的方法測定血漿醛固酮含量[碘(125I)醛固酮放射免疫分析藥盒]。

1.5 小鼠尾動脈血壓及脈搏的檢測

在小鼠清醒狀態(tài)下，使用小鼠無創(chuàng)血壓分析系統(tǒng)BP2000(visitech公司)測定其尾動脈收縮壓、舒張壓及脈搏。該系統(tǒng)采用光電容積脈搏波描記法(photoplethysmography)通過感受尾部血管擴張和收縮時吸收的光的變化記錄血管壓力的改變，同時計數(shù)脈搏，連續(xù)3d每日相同時間測量小鼠血壓10次，計算每只小鼠有效收縮壓、舒張壓及脈搏數(shù)據的平均值作為該小鼠該次測量結果。

1.6 24 h尿離子排泄量的檢測

實驗過程持續(xù)約1個月，設計師定期提交作品并集中展示，管理者根據提交作品的評價和引用情況畫出協(xié)作網絡圖張貼在展示區(qū)供參考。對設計師提交作品的數(shù)量無強制要求。

小鼠特制代謝籠(MMC100 metabolic cage, hatteras instruments inc.USA)中飼養(yǎng)小鼠，不限食和飲水。24 h后收集所有尿液，常溫下7 000r/min離心10 min，-80 ℃保存用于后續(xù)檢測,檢測方法同血標本。

1.7 腎臟病理標本的處理及觀察

腹腔注射1%水合氯醛(300～400 mg/kg)麻醉處死小鼠，低溫解剖快速分離單側腎臟皮質，液氮快速凍存后，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。另一側腎臟使用4%甲醛固定腎組織標本48 h以上，常規(guī)進行脫水、浸蠟、包埋、切片,行HE、PAS染色。使用Olympus光學顯微鏡分別在100、200及400倍鏡下觀察，并用Nikon Digital Sight圖像采集系統(tǒng)在相同條件下拍照，收集圖像信息。

1.8 腎素免疫組化的染色

石蠟切片(厚度3 μm)脫蠟水化后，枸櫞酸鹽pH 6.0緩沖液高壓修復3 min。用10%正常兔血清封閉非特異性染色60 min。加1∶200稀釋的綿陽抗腎素抗體(AF4090,Ramp;D Systems公司)4 ℃孵育過夜，TBS洗3次。再用3% H2O2封閉內源性過氧化物酶15 min，TBS洗3次。滴加1∶500稀釋的辣根酶標記兔抗綿羊二抗(E030150，EarthOx公司)。用DAB顯色，蘇木素復染核，中性樹膠封片，具體方法見本實驗室常規(guī)[3]，置顯微鏡下觀察，利用Olympus光學顯微鏡和Nikon Digital Sight圖像采集系統(tǒng)進行拍照。使用Image Pro Plus軟件6.0版本進行圖片分析，計算平均每個腎小球腎素陽性腎小球旁器區(qū)域面積和腎素陽性腎小球旁器與腎小球個數(shù)的比值。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠繁殖及生長情況

雌A1AR+/-小鼠孕期3～4周，每窩產仔6～10只，哺乳期3周。仔鼠雌雄比例約為1∶1。A1AR+/-、A1AR-/-與A1AR+/+C57BL/6J小鼠相比，生長發(fā)育及生活習性無明顯差異。不同基因型雄鼠與雜合子雌鼠交配繁育后代的基因情況經過Hardy-Weinberg平衡檢驗，基本符合孟德爾定律(χ2=0.17,P=0.68)(表2)。仔鼠出生2周齡進行標號，標號后至2月齡之內，A1AR+/+仔鼠死亡3只(4.91%)，A1AR-/-仔鼠死亡2只(4.65%)，二者無顯著差異。選用基因型為A1AR+/+和A1AR-/-的小鼠進行后續(xù)實驗。

表2 不同基因型小鼠交配后子代的比例

2.2 一般情況和血生化指標

自然生長過程中，各個周齡A1AR-/-與A1AR+/+小鼠質量之間無差異，在2～6周質量處于快速增長期，15周以后，質量變化不大(圖2)。其中2周齡A1AR+/+小鼠n=18，A1AR-/-小鼠n=11；6周齡A1AR+/+小鼠n=12，A1AR-/-小鼠n=8；10周齡A1AR+/+小鼠n=25，A1AR-/-小鼠n=10；15周齡A1AR+/+小鼠n=6，A1AR-/-小鼠n=5；20周齡A1AR+/+小鼠n=5，A1AR-/-小鼠n=5。

正常鹽飲食和低鹽飲食2周后，A1AR-/-小鼠基礎收縮壓、舒張壓及心率與周齡匹配的A1AR+/+小鼠無顯著差異。同組小鼠，低鹽飲食兩周后收縮壓和舒張壓也無明顯差異(表3)。

2.3 腎臟病理的特點

20周時腎臟HE染色和PAS染色，A1AR+/+和A1AR-/-小鼠的腎小球、腎小管間質和血管等無明顯差異(圖3)。

圖2 A1AR+/+和A1AR-/-小鼠在各周齡的體質量Fig 2 Body weight of A1AR+/+ and A1AR-/- mice at different ages

低鹽飲食下，A1AR-/-小鼠基礎狀態(tài)的腎功能、血清尿酸、電解質、血糖、血脂水平與A1AR+/+小鼠無顯著差異(表4)。

2.4 低鹽飲食小鼠腎臟腎素表達的差異

A1AR-/-與A1AR+/+小鼠低鹽飲食4周，免疫組化染色可見A1AR-/-小鼠腎皮質腎素表達增加(圖4)。半定量分析顯示，A1AR-/-小鼠腎皮質平均腎素陽性腎小球旁器區(qū)域面積和比例顯著高于A1AR+/+小鼠(Plt;0.05)(圖5)。

2.5 兩組小鼠血漿醛固酮及尿電解質排泄量

正常鹽飲食組，A1AR+/+與A1AR-/-兩組小鼠的血漿醛固酮水平接近；低鹽飲食組，A1AR-/-小鼠的血漿醛固酮水平顯著高于A1AR+/+小鼠(Plt;0.01)(圖6A)。低鹽飲食對24 h尿Na+和Cl-的排泄量無明顯影響，但A1AR-/-小鼠的K+排泄量明顯高于A1AR+/+小鼠(Plt;0.05)(圖6B)。

3 討論

本研究觀察到A1AR-/-小鼠在低鹽狀態(tài)下RAS的進一步活化，提示A1AR可能參與了低鹽刺激腎素分泌過程中的反饋機制。低鹽促使腎素分泌的機制首先是容量降低通過壓力感受器直接刺激腎素分泌，上調血管緊張素和醛固酮水平，從而促使遠端小管和集合管重吸收鈉增加，促進容量的恢復；其次，低容量使到達遠端腎小管致密斑的Na+和Cl-濃度降低，通過激動COX2和抑制nNOS的旁分泌途徑，促使入球小動脈壁的腎小球旁器顆粒細胞分泌腎素，相關機制分別在體外實驗、COX2和nNOS基因敲除小鼠中得到證實[4-5]。在致密斑途徑中，因為NaCl主動轉運減少，消耗的ATP降低，腺苷產生減少，TGF反應降低，擴張入球小動脈，而主要受血管緊張素Ⅱ調節(jié)的出球動脈收縮，單個腎小球的濾過率(glomerular filtration rate, GFR)增加，改善遠端小管內的低鈉和低氯狀態(tài)；A1AR基因缺失，低鹽對入球動脈的調節(jié)作用消失[6-8]，腎小球的灌注和遠端小管鈉和氯離子濃度不能恢復，促使致密斑刺激腎素分泌的機制持續(xù)存在，故腎小球旁器腎素及其下游醛固酮增加，尿鉀排出增加。此外，有研究表明，分泌腎素的腎小球旁器顆粒細胞上有A1AR受體表達，其活化會直接抑制腎素分泌，A1AR基因敲除，其抑制作用消失，腎素表達也會增加。本研究還在低鹽的A1AR基因敲除小鼠中觀察到JGA細胞之外的球外系膜細胞和小動脈平滑肌細胞均有腎素表達， 筆者在遺傳性失鹽性腎病Gitelman綜合征也觀察到類似情況，從而證實了低鹽促使腎素上調的結構基礎。

表3 不同飲食時兩組小鼠的血壓和心率Table 3 The blood pressure and heart rate between A1AR+/+ and A1AR-/-mice with different diets

表4 A1AR+/+及A1AR-/-小鼠血清電解質及腎功能Table 4 The serum electrolytes, renal function in A1AR+/+ and A1AR-/- mice

A.A1AR+/+mice(HE×100)；B.A1AR-/-mice(HE×100)；C.A1AR+/+mice(HE×200)；D.A1AR-/-mice(HE×200)；E.A1AR+/+mice(PAS×100)；F.A1AR-/-mice(PAS×100)；G.A1AR+/+mice(PAS×200)；H.A1AR-/-mice(PAS×200)

圖320周時兩組小鼠的腎臟病理
Fig3Kidneypathologypictureat20weeksoldintwogroupsofmice

A.A1AR+/+ mice(×100)；B.A1AR-/- mice(×100)；C A1AR+/+ mice(×400)；D A1AR-/- mice(×400)圖4 免疫組化分析腎臟皮質腎素表達Fig 4 Immunohistochemical localization of renin in nephron cortex

A.the ratio of positive area of renin and glomerulus quantity；B.the percentage of JGA quantity of positive renin and glomerulus quantity；*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with A1AR+/+group

圖5免疫組化腎素表達半定量分析
Fig5ThesemiquantitativeanalysisofImmunohistochemicallocalizationofreninexpression(n=4)

A.plasma aldosterone of two group mice in different diets; B.urine electrolyte excretion during 24 hours of two group mice in low salt diet;*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with A1AR+/+group

圖6兩組小鼠的血漿醛固酮及尿電解質排泄
Fig6Plasmaaldosteroneandurineelectrolyteexcretionduring24hoursinA1AR+/+andA1AR-/-mice(n=5)

與文獻報告相似，盡管RAS活化，A1AR-/-小鼠腎臟血壓并沒有顯著的變化[5，9]，影響血壓的因素很多，腎素活化并不是決定血壓的唯一因素，相對容量的變化可能更為重要，低鹽本身是WHO推薦飲食控制血壓的重要措施。事實上長期低鹽飲食，會下調激活RAS的鈉和氯調定點，達成新的平衡。遺憾的是這方面的研究并不多，需要更多的證據來闡明其機制，而利用A1AR-/-小鼠對于更深入研究管球反饋對腎素調控，及其下游血壓和水鹽的調節(jié)作用有重要幫助。

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Potential role of A1AR in renin secretion stimulated by low salt diet in mice

HAO Jin-ling1,2#, LIU Lin1#, JIANG Lan-ping1, SHI Xiao-xiao1, WEN Yu-bing1,LI Rong-shan2, CHEN Li-meng1*

(1.Dept. of Nephrology, CAMS amp; PUMC, Beijing 100730；2.Dept. of Nephrology, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000,China)

ObjectiveTo observe the pathogenesis of adenosine A1 receptor (A1AR) gene knockout mice and to investigate the role of A1AR in renin secretion stimulated by low salt diet.MethodsAfter A1AR+/-mice of C57BL/6J mating, multiplication and gene identification, offspring mice were sampled. The differences of following items between A1AR+/+(n=13)and A1AR-/-(n=14)mice were recorded: body weight, blood pressure, heart rate, renal function and electrolyte profile of serum and urine; Pathology features were microscopied after regular staining on kidney tissue samples. Renin expression at the kidney was stained by Immunohistochemistry. Plasma aldosterone level was also examined(A1AR+/+group,n=5,A1AR-/-groupn=5).ResultsAfter low salt diet, much higher renin expression of the kidney cortex and plasma aldosterone level was observed in A1AR-/-mice, accompanied with increasing of 24-hour urine potassium excretion (Plt;0.05).ConclusionsA1AR may mediate the renin secretion stimulated by low salt diet in mice.

low salt diet; A1AR; renin

2014-01-09

2014-03-12

科技部973項目(2012CB517803)，國家自然科學基金(81170674,30971369)

*通信作者(correspondingauthor)：chenlpumch@163.com

1001-6325(2014)05-0615-07

R 322.6

A